淡色库蚊击倒抗性（kdr）相关钠离子通道基因多态性研究

发布时间：2018-12-24 10:58

【摘要】： 蚊可传播多种疾病。蚊媒防制是蚊媒病防治的主要策略。化学防制是蚊媒防制的主要方法,然而杀虫剂的大量持续使用导致了蚊抗药性的发生和发展。抗药性已成为蚊媒病防治的最大障碍。抗药性检测是蚊媒抗药性治理的前提。从蚊击倒抗性相关基因中寻找适用于现场抗药性检测的分子靶标是当前蚊媒防制研究的重点。本研究以淡色库蚊6个自然种群为研究对象,采用PCR扩增、基因序列分析等方法,以个体大样本、从种群水平研究抗药性的策略,分析击倒抗性相关钠离子通道基因型(kdr基因型)与拟除虫菊酯抗性表型、kdr等位基因频率与种群抗药性水平的关系,并初步探讨杀虫剂选择压力下kdr基因的进化,以期为建立蚊拟除虫菊酯抗性现场检测和监测方法奠定基础。本研究的主要结果如下: 1.淡色库蚊南京敏感种群中,kdr基因存在3种基因型:L1014/L1014、L1014/L1014F和L1014F/ L1014F,包含1种突变L1014F(TTT);唐口抗性种群中,kdr基因存在6种基因型:L1014/L1014、L1014/L1014F、L1014F/ L1014F、L1014/L1014S、L1014S/L1014S和L1014F/L1014S,包含2种突变L1014F(TTT)和L1014S(TCA)。唐口抗性种群kdr基因突变型L1014F/L1014F纯合子为55.6%(55/99),显著高于南京敏感种群的20.2%(20/103)(p0.001);南京敏感种群野生型L1014/L1014纯合子比例为38.8%(40/103),显著高于唐口抗性种群的9.1%(9/99)(p0.001)。南京和唐口2个种群生物测定后分别分为敏感组(死亡组)和抗性组(存活组),经各组kdr基因型分析发现,2个种群敏感组的野生型L1014/L1014纯合子比例:南京46.9%(38/81)、唐口20.0%(4/20),均显著高于抗性组:南京12.5%(2/16)、唐口6.3%(5/79)(p0.001);2个种群抗性组的kdr基因突变型L1014F/L1014F纯合子比例:南京72.7%(16/22)、唐口65.8%(52/79),均显著高于敏感组:南京4.9%(4/81)、唐口15.0%(3/20)(p0.001)。结果表明,南京和唐口2个种群的kdr基因L1014F突变与拟除虫菊酯抗性表型密切相关,提示kdr基因L1014F突变可能可作为蚊拟除虫菊酯抗性现场检测的分子靶标。 2.无锡、微山、淮北和青岛4个种群生物测定后分别分为敏感组(死亡组)和抗性组(存活组),经各组kdr基因型分析发现,4个种群敏感组的野生型L1014/L1014纯合子比例:无锡51.5%(33/64)、微山51.9%(28/54)、淮北59.5(25/42)、青岛60.0%(21/35),均显著高于抗性组:无锡9.1%(3/33)、微山17.9%(7/39)、淮北14.8%(8/54)、青岛8.7%(6/69)(p0.001);4个种群抗性组的kdr基因突变型L1014F/L1014F纯合子比例:无锡72.4%(50/69)、微山68.5%(37/54)、淮北48.7%(19/39)、青岛60.6%(20/33),均显著高于敏感组:无锡11.4%(4/35)、微山11.9%(5/42)、淮北9.3%(4/54)、青岛7.8%(5/64)(p0.001)。本结果进一步验证了南京和唐口种群的研究结果,即kdr基因L1014F突变与拟除虫菊酯抗性表型密切相关,该kdr基因突变可以作为蚊拟除虫菊酯抗性现场检测的分子靶标。南京等6个种群敏感组和抗性组,kdr基因L1014S突变均无显著性差异(Paired t-test, t=1.65, d.f.= 5, P=0.16)。 3.经WHO成蚊接触筒生物测定,南京、无锡、微山、淮北、青岛、唐口6个种群的存活率分别为21.4%、34.1%、41.9%、56.6%、66.3%、79.8%;6个种群的kdr基因L1014F等位基因频率分别为40.3%、38.1%、38.7%、51.0%、60.1%、71.7%。使用回归分析发现,淡色库蚊6个自然种群的kdr基因L1014F等位基因频率与抗药性水平具有正相关性,相关性方程为y=1.4681x-23.365,相关系数r2 = 0.870, p0.0001。提示kdr基因L1014F等位基因频率可望用于蚊自然种群拟除虫菊酯抗性的动态监测,值得进一步研究。南京等6个种群的抗药性表型与kdr基因L1014S等位基因频率无相关性(r2 = 0.110, p0.05)。 4.使用溴氰菊酯对淡色库蚊唐口自然种群进行逐代筛选,在实验室建立了低抗性、高抗性品系。 5.在实验室溴氰菊酯逐代筛选实验中,通过逐代kdr基因型检测,发现L1014F突变频率随着溴氰菊酯筛选呈规律性增加,两者具有显著相关性(p0.001);而L1014S突变频率与溴氰菊酯筛选未发现有相关性。提示在溴氰菊酯抗性的发生、发展中,L1014F突变可能具有关键性作用;而L1014S突变可能与之不相关或不直接相关,有待进一步研究。 6.建立了可用于蚊抗药性现场检测和监测的2种分子生物学方法:等位基因特异性PCR(AS-PCR)方法和实时TaqMan探针方法。与AS-PCR方法相比,TaqMan探针方法在检测kdr基因型时具有更高的扩增效率,更好的敏感性和特异性,值得现场推广使用。本研究结果为建立蚊拟除虫菊酯抗性现场检测和监测方法奠定了基础,并为进一步阐明抗药性的分子机理和制定蚊媒综合防制策略提供了科学依据。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R384

【参考文献】