钙敏感受体对大鼠肝脏缺血—再灌注损伤的影响及机制

发布时间：2018-12-27 12:56

【摘要】：钙敏感受体（CaSR）属G蛋白耦联受体，在维持机体钙稳态中起重要作用，同时也参与调节细胞分化、增殖、凋亡、基因表达和激素分泌等。肝脏缺血-再灌注损伤是肝手术过程中不可避免的，也是肝脏病学的研究热点。但是钙敏感受体在肝脏缺血-再灌注损伤中的作用及其机制，迄今国内外未见报道。目的观察大鼠在体肝脏缺血-再灌注损伤时CaSR的表达变化及与肝脏损伤的关系；CaSR在缺氧-复氧诱导BRL大鼠肝细胞系凋亡中的作用及信号转导途径。方法（1）采用门静脉、肝动脉、胆管左支结扎和松结的方法，复制大鼠在体肝脏缺血-再灌注损伤模型，测定血清ALT、AST、SOD、NO活性和MDA含量；透射电镜观察肝脏超微结构变化；应用RT-PCR、Western blot技术分别测定假手术组、缺血-再灌注1h、2h、4h和6h时肝脏组织中CaSRmRNA和蛋白的表达变化。（2）选择BRL大鼠肝细胞系作为研究对象，采用RT-PCR、Western blot和免疫荧光技术分别检测在BRL大鼠肝细胞系上有无CaSR mRNA和蛋白的表达及分布，激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内钙的实时变化，同时观察GdCl3（CaSR的激动剂）对上述指标的影响。（3）BRL大鼠肝细胞系，在37℃条件下采用95％N2＋5％CO_2模拟缺血培养4小时后，更换为正常DMEM培养液常规培养10小时，建立BRL大鼠肝细胞缺氧-复氧模型。透射电镜观察肝细胞结构的变化；利用MTT比色法、Hoechest33342染色和流式细胞术检测肝细胞存活率和凋亡率；激光扫描共聚焦显微镜测定BRL细胞内[Ca~(2+)]i的变化；以GdCl_3（CaSR的激动剂）和NPS-2390（CaSR的抑制剂）作为干预因素, Western blot观察BRL细胞CaSR的表达,caspase-3和Bax/Bcl-2的蛋白的表达,分析细胞色素c（Cyt-c）的释放，观察CaSR在细胞凋亡中的作用；Western blot检测ERK和P38通路的蛋白表达，分析CaSR下游信号转导通路。结果（1）大鼠在体肝脏缺血-再灌注损伤时，随再灌注时间延长SOD的活性减低，ALT、AST、NO活性和MDA含量升高；肝脏超微结构损伤加重；大鼠肝脏缺血-再灌注1h、2h肝组织CaSR的mRNA和蛋白表达升高，再灌注4h、6h后降低。（2）CaSR在BRL大鼠肝细胞系中有表达，并且主要分布在胞膜和胞浆中；增加细胞外钙或者给予GdCl_3都可以引起细胞内钙的增加，并且使CaSR的表达明显增加；这种细胞内钙的增加可以被U73122（PLC的抑制剂），2-APB（IP_3受体的抑制剂）或者是毒胡萝卜素（内质网钙泵的抑制剂）所抑制甚至取消。（3）模拟缺氧-复氧后BRL细胞凋亡增加，BRL细胞超微结构损伤明显, CaSR的蛋白表达明显增加。GdCl_3能够使缺氧-复氧所诱发的CaSR蛋白、线粒体通路凋亡蛋白，磷酸化ERK1/2和P38的蛋白表达进一步增加，，[Ca~(2+)]_i增高，缺氧-复氧BRL细胞凋亡加重；NPS2390的作用相反。结论（1）在体大鼠肝脏缺血-再灌注损伤模型中，CaSRmRNA和蛋白的表达在再灌注早期升高，晚期降低。肝组织损伤随再灌注时间延长而加剧。（2）在BRL大鼠肝细胞系中存在CaSR的表达，并且CaSR可通过PLC-IP_3通路介导BRL细胞内钙超载。（3）模拟缺氧-复氧BRL细胞模型中，CaSR激活线粒体途径介导BRL细胞凋亡；同时启动MAPK通路发挥促凋亡和抑凋亡作用，但其促凋亡作用占主导。
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【学位授予单位】：哈尔滨医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

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