多重耐药鲍曼不动杆菌临床株与RND型和MATE型外排泵的研究

发布时间：2018-12-28 14:27

【摘要】： 目的:鲍曼不动杆菌的耐药性近年呈现逐渐上升的趋势,给临床治疗带来严峻挑战。主动外排泵与细菌耐药密切相关。本试验采用分子生物学方法研究鲍曼不动杆菌临床株的多重耐药表型、泵抑制剂的干预作用及主动外排系统:RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因携带、表达及外排泵AdeABC的调控系统AdeRS的基因序列变化情况,为指导临床合理使用抗菌药物、减少细菌耐药性的出现或传播、新型抗菌药物的研制提供依据。 方法: 1、菌株收集、药敏试验与泵抑制剂干预试验:收集自2006年1月至2008年6月期间天津市3家三级甲等医院临床分离的鲍曼不动杆菌共35株,其中多重耐药株30株,敏感株5株。采用微量肉汤稀释法和琼脂纸片扩散法测定临床菌株对13种常用抗菌药物(哌拉西林、头孢氨噻肟、头孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星)的MIC值,分析耐药率。采用微量肉汤稀释法测定未加用和加用泵抑制剂CCCP时菌株对8种抗菌药物(左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢他定、头孢哌酮/舒巴坦)的MIC值,分析泵抑制剂对菌株耐药表型的影响。 2、RND型外排泵AdeABC、AdeIJK和MATE型外排泵AbeM的泵基因检测及mRNA的表达:应用聚合酶链式反应(PCR)扩增全部实验菌株的adeB、adeJ和abeM基因,选择10株多重耐药株和5株敏感株进行RT-PCR反应,以内参基因recA为对照,进行凝胶扫描半定量分析。 3、RND型外排泵AdeABC的调控系统AdeRS的编码基因检测及序列分析:应用PCR方法扩增adeR和adeS基因,选择2株多重耐药株和2株敏感株的扩增产物测序,并与GenBank公布的序列进行比对分析。 结果: 1、药敏试验结果和泵抑制剂对耐药表型的影响:30株多重耐药的鲍曼不动杆菌临床株对抗菌药物的耐药率为:环丙沙星(100%),氧氟沙星(100%),哌拉西林(100%),头孢噻肟(100%),头孢他定(100%),头孢哌酮(100%),头孢曲松(100%),头孢吡肟(100%),庆大霉素(100%),阿米卡星(100%),左氧氟沙星(50%),头孢哌酮/舒巴坦(26.67%),亚胺培南(10%)。30株多重耐药株在使用CCCP后均出现了对一种或一种以上抗菌药物的MIC值较前下降4倍或4倍以上。5株敏感株在应用CCCP后,其中2株对氧氟沙星的MIC值较前下降2倍,1株对头孢他定的MIC值较前下降2倍,2株对庆大霉素的MIC值较前下降2-4倍。 2、外排泵基因检测及mRNA的表达情况:30株多重耐药株和5株敏感株均携带泵基因adeB、adeJ和aheM,10株多重耐药株的adeB相对表达水平(灰度)为(1.211-9.169),而adeB基因在5株敏感株中均未检测到mRNA表达;10株多重耐药临床株的adeJ相对表达水平(灰度)为(0.956-4.519),平均1.75;5株敏感株为(0.356-0.576),平均0.426;abeM基因在10株多重耐药株和5株敏感株中均未检测到mRNA表达。 3、调控基因adeRS的检测及序列比对:检测2株敏感株AbS2与AbS5的adeR序列相同,与GenBank中公布的AY426969比对,同源性为97%。耐药株AbM1与AbM4的adeR基因序列相同,与AY426969比对同源性为97%。AbM1、AbM4与AbS2、AbS5 adeR基因推导的氨基酸序列比对出现:Ile14→Val、Val120→Ile、Ala136→Val。AbS2与AbS5的adeS序列相同,与AY426969比对同源性为97%。AbM1与AbM4的adeS基因序列相同,与AY426969比对同源性为96%。AbM1、AbM4与AbS2、AbS5 adeS基因推导的氨基酸序列比对出现:Gly186→Val、Asn213→Asp、Ile285→Leu、Asn268→His、Val331→Ile、Val348→Ile、Gly356→Asn、His357→Asn,357位后氨基酸缺失。 结论: 1、泵抑制剂CCCP的应用,可使鲍曼不动杆菌多重耐药株对一种或多种抗菌药物MIC值较前降低,这表明外排泵功能对鲍曼不动杆菌多重耐药有一定贡献。 2、RND型外排泵基因adeB和adeJ在10株多重耐药株和5株敏感株中的表达差异,可能与鲍曼不动杆菌的多重耐药有关。MATE型外排泵基因abeM在多重耐药株和敏感株中均未检测到mRNA的表达,有待扩大实验例数进一步研究。 3、2株多重耐药株和2株敏感株的调控基因adeRS基因序列推导的氨基酸序列比对,出现氨基酸替代和缺失,可能与外排泵AdeABC表达差异有关,基因变异与蛋白结构和功能的关系有待于进一步研究。敏感株AbS5的adeRS基因序列已提交GenBank,登录号为FJ495118、FJ600366。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378.99

【参考文献】

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本文编号：2394071