黏膜佐剂与鼠疫融合F1-V重组蛋白抗原滴鼻免疫效果的初步研究

发布时间：2018-12-30 17:19

【摘要】： 鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Y.pestis)引起重要烈性传染病,主要分为腺鼠疫、败血症鼠疫和肺鼠疫,其中肺鼠疫具有传染性强和致死率高的特点。特别是近年鼠疫呈死灰复燃之势,同时它又是重要的生物恐怖制剂之一,因此鼠疫已成为潜在威胁人类健康和国家安全的重大现实问题。疫苗是有效防控传染病的手段之一。由于传统的鼠疫疫苗存在对肺鼠疫无效,并且副反应大,至今没有实用的人用疫苗。基于肺鼠疫通过呼吸道感染的特点,激发黏膜免疫反应是预防肺鼠疫的研究重点。而传统的铝佐剂,注射后不能诱导粘膜免疫来阻断和中和毒素;霍乱毒素等黏膜佐剂,黏膜免疫效果好,但副作用大等问题。因此,寻找安全、有效的黏膜佐剂用于鼠疫黏膜疫苗的研究非常重要。蛋白体(Proteosome)是脑膜炎奈瑟氏双球菌的外膜蛋白,是多个孔道蛋白形成的囊泡样大小不同的豪微粒结构体,具有疫苗投递载体和佐剂的特征。PorB蛋白是脑膜炎双球菌的重要外膜孔道蛋白之一,是蛋白体的主要组成成分,约占其组成的60%。PorB蛋白也有类似蛋白体的免疫增强剂活性。近几年,国内外把蛋白质佐剂和从蛋白体中提取的PorB蛋白作为黏膜佐剂应用在很多疫苗的研制中,主要用于鼻内接种疫苗,并且具有实质性进展,但是对PorB重组蛋白作为佐剂的研究还未见报道。诸多研究发现,鼠疫F1、V已成为鼠疫新一代疫苗研制的首选保护性抗原分子,也是鼠疫新型疫苗研究的重点。本研究以制备的蛋白体、PorB重组蛋白粘膜佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原按一定比例配置黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠,从粘膜免疫角度探讨鼠疫F1-V融合重组蛋白黏膜疫苗诱导的黏膜和系统应答效果,为筛选安全、有效鼠疫粘膜疫苗佐剂奠定坚实的基础。首先,通过优化的条件,从脑膜炎B群2b型奈瑟氏双球菌中成功提取了高纯度的蛋白体,其主要由PorA,PorB和4类孔道膜蛋白三种成分组成,相对分子质量分别为41 ku,38 ku和34 ku。并且蛋白体中脂多糖、荚膜多糖和核酸的含量都符合生物制品佐剂的要求,且通过了异常毒性试验。证明了蛋白体作为疫苗佐剂的安全性,为疫苗的研究提供了黏膜佐剂。然后,通过基因工程技术,根据基因文库中提供的目的基因序列设计引物,从B群2b型脑膜炎奈瑟氏双球菌中扩增porB的基因序列,将其克隆入表达质粒,构建porB-pET28a(+)表达载体,通过IPTG诱导实现PorB重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高表达,并对纯化的表达蛋白产物了进行纯化和Western blot鉴定,获得了高纯度的PorB重组蛋白,为进一步深入研究黏膜佐剂效应奠定了结实基础。最后,将PorB重组蛋白佐剂和蛋白体佐剂分别与鼠疫F1-V融合重组蛋白制备滴鼻疫苗剂型,并与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原做对照。分别滴鼻免疫Balb/c小鼠三次,取尾静脉血,采用ELISA检测血清IgG及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液sIgA;采用FAC检测脾淋巴细胞表型的变化。在本试验中,PorB重组蛋白佐剂和蛋白体佐剂均可诱导小鼠在肺、鼻咽喉和阴道中产生较高的黏膜分泌型IgA抗体而且小鼠血清IgG抗体水平显著高于鼠疫F1-V抗原组对照组,引起IgG1抗体为主,主要诱导Th2型免疫反应;同时PorB重组蛋白佐剂和蛋白体佐剂还可显著提高在脾脏中的CD4+细胞数,免疫反应趋向Th2反应。而且在各项检测中PorB重组蛋白佐剂疫苗组与蛋白体佐剂疫苗组无显著性差异。试验结果表明,PorB重组蛋白佐剂和蛋白体佐剂均可显著提高鼠疫F1-V融合重组蛋白疫苗的系统免疫应答和黏膜免疫应答,且PorB重组蛋白佐剂的免疫效果可与蛋白体佐剂相媲美。结论,PorB重组蛋白佐剂可用于鼠疫F1-V融合重组蛋白黏膜疫苗的研究,为鼠疫安全、有效免疫预防奠定了理论基础。同时也为其它黏膜感染性疾病疫苗的研究提供了保证。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】