睾酮对亚急性衰老小鼠下丘脑的影响及其机制的研究

发布时间：2019-01-03 07:50

【摘要】： 研究背景: 人口老龄化是二十一世纪人类发展的主要特征,在我国尤其明显。根据新公布的国家人口发展战略研究报告表明,二十世纪末,我国60岁以上老年人口占总人口的比例超过10%;2005年底,我国60岁以上老年人口近1.44亿,占总人口的比例达11%;当前,我国老年人口正以年均约3%的速度增长,并将以每10年纯增1亿老年人口的速度加速老龄化进程。随着老年人口的增多,我国老年人疾病谱也由相对分散向相对集中转变,发病率前五位是高血压、冠心病、脑血管病、糖尿病、肿瘤。其中以脑老化为表现的疾病在老年人群中的高发病率使其成为威胁老年人健康的重要疾病。因此急需开展脑老化发病机制及防治对策的研究。脑老化发生的传统危险因素包括年龄、高血压、高血脂、吸烟、高血糖、以及性别等,以往一直认为年龄属于脑老化不可改变的危险因素,因此研究相对较少。随着人口老龄化的日益发展,有关年龄在脑老化发生发展机制的研究逐渐引起重视,并成为防治脑老化的新靶点。流行病学研究表明年龄是脑老化发生与发展的独立的危险因素,随着年龄的增加,促使脑老化的发生率显著升高的一个最具有老年人特点的原因是脑组织随增龄发生了变化,部分脑细胞发生了衰老,表现为脑重量的下降、脑神经细胞数量减少及脑细胞中出现老年色素等。现在越来越多的研究表明脑老化状态下的脑细胞处于衰老状态,脑细胞的衰老是脑老化的重要原因这一观点已被广泛认同。研究发现,作为高级神经内分泌中枢的下丘脑是脑老化过程中较先出现老化的部位,提示下丘脑可能在衰老发展中起重要作用。现在不少老年医学的专家建议将抗衰老治疗当作治疗脑老化的一项新的治疗策略。那么随着增龄脑组织为什么会发生这些变化,脑细胞为什么会衰老,隐藏在脑老化后的细胞和分子水平的衰老机制是什么?这种机制是否可为改善或者延缓脑老化提供重要思路?在人口老龄化日益发展的现状下,这已成为脑老化防治急需回答的关键问题之一。在增龄过程中,另一个显著变化是性激素平衡的改变。睾酮是男性体内最重要的雄激素,属于一种合成激素,研究发现,男性50岁后体内总睾酮及生物活性睾酮水平逐渐出现明显下降。老年男性血浆睾酮水平与多种增龄相关性疾病发病率呈负相关。多项睾酮替代治疗的临床试验发现,睾酮可改善老年人认知能力、调整肌肉脂肪比例,加强肌肉力量,增强运动能力,抑制血脂异常。减少胰岛素抵抗,改善性功能等等,但睾酮能否改善老年男性的下丘脑功能,延缓老年性脑老化的发生,文献未见报道。我们之前的研究表明,睾酮在体外干预血管内皮细胞可抑制过氧化氢诱导的内皮细胞衰老,但对下丘脑函待研究。生物衰老的各种变化,不仅表现在宏观上,更主要的是表现在微观上。衰老机制的研究,现在已经从整体水平、器官水平发展到细胞水平、分子水平。随着细胞生物学、分子生物学等学科的迅速发展,目前国内外对衰老机制开展的多方面研究都有很大的进展,并提出若干具有较高水平的衰老学说,有自由基学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说、生物膜损害学说、遗传程序学说、染色体突变学说、差错学说、免疫学说、内分泌学说等。总体来讲上述这些学说可分为两大类:即一类为以ROS、糖基化、激素紊乱等损害为代表的环境伤害衰老理论,认为衰老是环境因素对细胞进行性和累积性毁坏的结果,另一类是以端粒缩短、细胞周期调控因子等为代表的遗传因子程序化衰老理论,认为衰老是机体有序的基因活动,是通过遗传按程序预先安排好的,或为特异的“衰老”基因所表达,或为可用基因的最终耗竭。这些学说从不同学科角度出发,对衰老机制进行了较为深入的探索,目前正逐渐向更深层次的研究方向发展,并已经逐渐走进了将上述两大理论进行合作的时代,即将研究集中在环境因子伤害造成衰老的遗传程序改变的相关范围之内。 D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠模型是目前常采用的衰老模型,在一定时间内通过皮下连续注射D-半乳糖,使机体细胞内半乳糖浓度增高,在醛糖还原酶催化下,还原成半乳糖醇,该物质不能在细胞内进一步代谢而堆积,影响细胞正常渗透压,导致细胞代谢紊乱,ROS堆积。D-半乳糖在体内可形成晚期糖基化终产物(AGE),AGE可加强ROS损伤并引起微管相关蛋白(Tau)异常磷酸化及细胞骨架微丝集结,参与了D-半乳糖诱导小鼠衰老过程,非酶性糖化作用也是促进ROS致脑衰老的途径之一。脑内ROS的堆积是否参与了脑老化的形成,其作用机制如何?目前尚不明确。研究目的: 本研究用睾酮干预D-半乳糖诱导的小鼠模型,通过对下丘脑组织切片形态结构的观察和SA-β-半乳糖苷酶活性的测定,探讨连续5个月皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d的小鼠下丘脑是否发生衰老及睾酮对下丘脑衰老是否具有干预作用;并且通过测定细胞周期调控因子p16~(INK4a)的表达变化来探讨下丘脑衰老的机制以及睾酮干预的可能途径。方法: 1、实验小鼠分组及模型的建立将SPF级8-12周龄24只C57雄性健康小鼠随机分为3组,每组各8只: (1)D-半乳糖组:背部皮下注射D-半乳糖溶液100mg/kg.d,用药5个月; (2)睾酮干预组:在D-半乳糖组基础上,背部皮下注射十一酸睾酮5mg/kg.2w,用药5个月; (3)正常对照组:背部皮下注射相等剂量生理盐水,1次/d,用药5个月。 2、模型建立后,观察各组小鼠一般情况(触须、体型等方面)及体重。 3、小鼠脑组织的分离和下丘脑组织切片的制作。 4、用HE染色法观察各组小鼠下丘脑组织切片的染色情况。 5、用SA-β-半乳糖苷酶染色法测定各组小鼠下丘脑染色阳性细胞百分比。 6、用免疫组化法测定各组小鼠下丘脑p16~(INK4a)蛋白表达阳性细胞率。统计分析: 实验数据用SPSS13.0软件分析。所得数据均以(?)±s表示。各组间数据比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P0.05(双侧)为差异有统计学意义。结果: 1.各组小鼠一般情况及体重: 模型建立后,D-半乳糖组小鼠普遍出现触须脱落、弓背、竖毛、行动迟缓等体征,而正常对照组小鼠触须完整,行动敏捷,无弓背、竖毛现象。睾酮干预组小鼠亦未出现触须脱落、弓背、竖毛、行动迟缓等体征。与正常对照组比较,D-半乳糖组小鼠体重明显降低,差异有显著性(P0.05);与D-半乳糖组比较,睾酮干预组小鼠体重明显升高,差异有显著性(P0.05),但仍低于正常对照组(P0.05)。 2.各组小鼠下丘脑HE染色情况在400倍镜下观察,正常对照组可见细胞结构清楚,神经元细胞数目多,细胞排列规整,核深染,核膜清晰,核仁明显;D-半乳糖组可见组织结构疏松,部分神经元细胞核固缩,胞体缩小变形,神经元细胞周围间隙增宽;睾酮干预组可见细胞结构清楚,神经元细胞数目较D-半乳糖组增多,核深染,核膜清晰,核仁明显。 3.各组小鼠下丘脑SA-β-半乳糖甘酶染色阳性细胞百分比 SA-β-半乳糖甘酶染色显示衰老细胞胞浆和胞核蓝染,定为阳性细胞。计算各组染色阳性细胞百分比后发现,D-半乳糖组染色阳性细胞百分比较正常对照组明显升高(P0.05),符合衰老细胞特征。睾酮干预使染色阳性细胞百分比较衰老组明显降低(P0.05),但仍高于正常对照组(P0.05)。 4.各组小鼠下丘脑p16~(INK4a)蛋白表达阳性细胞率与正常对照组比较,D-半乳糖组小鼠下丘脑p16~(INK4a)蛋白表达阳性细胞率明显升高,差异有显著性(P0.05);与D-半乳糖组比较,睾酮干预组小鼠下丘脑p16~(INK4a)蛋白表达阳性细胞率明显降低,差异有显著性(P0.05),但仍高于正常对照组(P0.05)。结论: 1.亚急性衰老小鼠下丘脑HE染色可见部分神经元细胞核固缩,衰老相关β-半乳糖甘酶染色阳性细胞百分比升高,p16~(INK4a)表达增多,说明D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠下丘脑发生了衰老。 2.睾酮干预可降低衰老相关β-半乳糖甘酶活性,延缓小鼠下丘脑的衰老。 3.睾酮对小鼠下丘脑衰老的干预作用部分是通过下调p16~(INK4a)蛋白表达来实现的。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R33

【参考文献】