滚环扩增技术检测结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB单碱基突变的应用研究

发布时间：2019-01-08 10:25

【摘要】：第一部分HRCA技术检测结核分枝杆菌rpoB基因单碱基突变目的：建立一种快速准确、经济简便的检测结核分枝杆菌rpoB基因单碱基突变的支链滚环扩增（hyper-branched rolling circleamplification，HRCA）技术。方法：1.通过查阅文献并进行临床调查，确立结核分枝杆菌rpoB基因531位点丝氨酸突变（C-T）的检测目标。根据结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的rpoB基因标准序列信息（从NCBI中获得），设计检测该基因突变位点的锁式探针以及用于临床标本耐药基因rpoB基因的PCR扩增引物。2.建立并优化检测结核分枝杆菌rpoB基因单碱基突变的支链滚环扩增技术，，包括：锁式探针与模板连接环化温度，连接环化时间；滚环扩增最适温度、扩增时间。3.通过对人工合成的野生型靶序列、突变型靶序列、其他非相关基因序列以及不加靶序列的反应体系进行检测，讨论该方法的特异性和灵敏度。4.采用支链滚环扩增技术对临床标本进行检测，验证该检测技术的临床应用价值。结果：1.锁式探针与相应模板65℃连接1h可保证检测的特异性。37℃滚环扩增1h，能够得到明显的扩增结果，且通过对不同浓度突变型靶序列样本的检测，采用该技术最低能检测出样本中含有1%的突变株。2.利用支链滚环扩增技术分别检测了临床结核杆菌利福平耐药株、利福平敏感株以及结核分枝杆菌标准株H37Rv。检测结果与测序结果一致。结论：我们建立的用于检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的支链滚环扩增技术，具有特异性高、灵敏度高、简单易操作的优点。本检测方法与传统方法相比，大大缩短了检测时间，而且不需特殊仪器和试剂，大大降低了检测成本。第二部分滚环扩增技术联合DNA芯片检测结核分枝杆菌rpoB基因突变目的：将滚环扩增技术与DNA芯片技术相结合，建立一种检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的芯片技术。方法：1.以结核分枝杆菌rpoB基因为研究对象，选择531位点的丝氨酸突变（C-T）作为检测目标，根据锁式探针与模板结合区外的序列设计通用寡核苷酸探针，作为捕获探针，用于包被醛基玻片。2.通过检测人工合成的野生型和突变型靶序列，证明所设计寡核苷酸探针的准确性及本检测方法的可靠性，并优化该方法的反应条件，同时讨论其特异性和灵敏度。3.利用本方法对临床样本进行检测，并将检测结果与样本测序结果比对，从而验证本方法的准确性及临床应用价值。结果：1.将设计好的捕获探针点于醛基片上预先设计好的点样点，对人工合成靶序列进行检测。相应突变型位点和阳性对照位点均有明显显影结果，背景清晰，阴性对照位点及其他点样点均无显影结果。证明设计的探针合理可靠，本检测方法特异性好且准确可靠。2.通过对不同浓度突变型靶序列样本的检测，研究发现该方法最低可检测出含有5fmol/L突变型靶序列的样本。3.采用本方法对临床样本进行检测，结果显示，阳性对照与突变型点样点均有明显显影结果，背景清晰；阴性对照、野生型、非该位点突变型及非结核序列点样点均无显影结果。该结果与临床样本测序结果一致，证明本检测方法准确可靠。结论：本研究成功建立了RCA联合DNA芯片技术，该技术可用于检测结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因单碱基突变，具有特异性高、灵敏度高，不需要特殊仪器，操作简单的特点，并可用于临床样本的检测。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416

【参考文献】