一个新的调节成骨细胞分化的microRNA的克隆及其功能研究

发布时间：2019-01-16 04:47

【摘要】： 目的：查找新的小鼠成骨细胞特异性表达或优先表达的microRNA (miRNA),并对其在多个组织器官和细胞中的表达模式进行研究。方法：首先提取小鼠成骨细胞的小分子RNA,经过Poly(A);加尾并连接5'端接头后逆转录为cDNA,随后进行PCR扩增、回收,连接至pcDNA3.1 TOPO载体构建小分子RNA的cDNA文库,最后进行菌落PCR,得到的阳性克隆测序后选取19-26nt大小的RNA进行生物信息学分析确定新的miRNA。用Northern印迹杂交检测新的miRNA在小鼠成骨细胞、破骨细胞、骨、肝脏、心脏、肺、肾脏、大脑、脂肪、脾及骨骼肌的表达情况。用BMP-2诱导ST2细胞向成骨细胞分化,Northern印迹杂交检测miRNA在此过程中的表达模式。结果：共克隆得到162个小分子RNA,有68个为miRNAs,包括2个新的miRNAs,其中1个提交miRBase数据库后命名为miR-2861。miR-2861位于小鼠第2条染色体,在人类基因组中存在保守性。miR-2861在小鼠成骨细胞及骨高表达,在肝脏表达较低,在其他组织和破骨细胞不表达。miR-2861在ST2细胞不表达,BMP-2诱导ST2向成骨细胞分化12h后可以检测到miR-2861表达,并随着诱导分化时间的延长,表达逐渐增加。结论：首次构建了小鼠成骨细胞小分子RNA的cDNA文库。首次发现一个新的成骨细胞优先表达的miRNA-miR-2861。MiR-2861在小鼠与人之间具有保守性,其表达随着成骨细胞分化的进展而逐渐升高,提示其可能参与了成骨细胞分化的调控过程。目的：研究miR-2861在小鼠基质细胞ST2和原代骨髓基质细胞(BMSCs)向成骨细胞分化中的作用。方法：根据miR-2861前体序列设计引物,退火后连接至pSilencer 4.1-CMV puro载体,构建miR-2861的表达载体pre-miR-2861。将pre-miR-2861分别转染ST2细胞和骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs),造成miR-2861过表达细胞模型,随后予300ng/ml BMP-2诱导分化,观察成骨细胞分化指标变化。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性用分光光度计检测对硝基苯酚释放获得,骨钙素(Osteocalcin, OC)用放射免疫测定法测定,细胞钙沉积量用邻甲酚酞络合铜比色法检测。Western杂交和实时定量PCR分别检测Runx2蛋白和mRNA表达的变化。用2'-O-methyl修饰的反义寡核苷酸anti-miR-2861瞬时转染ST2细胞和BMSCs,同样方法检测ALP活性、OC分泌以及细胞中钙沉积量变化,Runx2蛋白和mRNA表达分别用Western杂交和实时定量PCR检测。结果：(1)转染用pSilencer 4.1CMV puro构建的miR-2861表达载体pre-miR-2861能够在细胞中稳定地高表达miR-2861。(2)miR-2861过表达促进ST2和BMSCs向成骨细胞分化过程中的ALP活性增高和OC分泌,提高Runx2蛋白表达,而不影响Runx2 mRNA水平。ST2细胞转染pre-miR-2861能够增加细胞中的钙沉积量(3)抑制miR-2861降低ST2和BMSCs向成骨细胞分化过程中的ALP活性,减少OC分泌,降低BMP-2诱导引起的Runx2蛋白表达升高,但不影响Runx2 mRNA水平,转染ST2细胞5天后,钙沉积含量较对照组降低。结论：成功构建了miR-2861表达载体,过表达miR-2861可以促进ST2和BMSCs向成骨细胞分化,抑制miR-2861能够延缓ST2和BMSCs向成骨细胞分化。目的：预测并验证miR-2861作用的靶基因,阐明miR-2861促进成骨细胞分化的作用机制。方法：用多个靶基因预测软件分析得到miR-2861作用的靶基因。PCR扩增包含靶位点在内的靶基因编码序列(coding sequence, CDS),产物连接到pGL3载体,构建野生型靶基因CDS荧光素酶报告基因载体。以此为模板,用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒在靶位点中引入两个碱基突变,构建突变型靶基因CDS荧光素酶报告基因载体。将这两个载体分别与pre-miR-2861共同转染ST2细胞,检测荧光素酶活性变化以证实该靶基因是否为miR-2861作用的靶基因。ST2细胞单独转染pre-miR-2861,观察miR-2861对靶基因表达的影响,Western杂交和实时定量PCR分别检测靶基因蛋白和mRNA水平的变化,明确miR-2861对靶基因的调控作用。PCR扩增靶基因CDS全长cDNA,连接到pcDNA3.1(+)载体构建野生型靶基因表达载体,以此为模板,用QuickChange site-directed mutagenesis试剂盒在靶位点中引入两个碱基突变,构建突变型靶基因表达载体,这两个载体分别与pre-miR-2861或miR-C共同转染ST2细胞,加BMP-2诱导分化,观察ALP活性和靶基因蛋白表达,ALP活性用分光光度计检测对硝基苯酚释放获得,靶基因蛋白表达用Western杂交检测。结果：(1)软件预测HDAC5为miR-2861作用的靶基因。(2)与转染miR-C对照组相比,miR-2861过表达组HDAC5 CDS的荧光素酶活性显著下降,而转染突变型HDAC5 CDS的荧光素酶活性则无明显变化。(3)单独转染pre-miR-2861可以降低HDAC5蛋白水平,而对HDAC5 mRNA无影响。(4)pre-miR-2861与野生型HDAC5 CDS表达载体共转染可以增加ALP活性,降低HDAC5蛋白表达,而pre-miR-2861与突变型HDAC5 CDS表达载体共转染则不会产生这种作用。表明miR-2861在成骨细胞分化中的作用完全或主要是通过作用与HDAC5来完成的。结论：(1)成功构建了野生型和突变型HDAC5 CDS荧光素酶报告基因载体、野生型和突变型HDAC5表达载体。(2)软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实HDAC5为miR-2861作用的靶基因。(3)miR-2861通过转录后水平抑制HDAC5表达,促进成骨细胞分化。(4)HDAC5是miR-2861在成骨细胞分化中最重要的靶基因。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】