拟态弧菌ompU多表位基因的设计、表达及其免疫特性分析

发布时间：2019-01-20 18:01

【摘要】： 由拟态弧菌(Vibrio mimicus)引起的腹水病是水产动物常见的、危害严重的细菌性疾病之一。由于目前尚无商品化的拟态弧菌疫苗可供水产动物使用,养殖基层控制该病的手段主要是依赖抗菌药物,但是随着抗菌药物的反复使用,细菌产生耐药性,抗菌疗效不明显,常导致患病动物大批死亡,给水产养殖业带来了严重的经济损失。因此,开展新型高效的拟态弧菌疫苗的研究迫在眉睫。本研究选择拟态弧菌外膜蛋白OmpU为靶标,应用生物信息学软件筛选OmpU B细胞表位和优化设计多表位串联基因的基础上,通过基因克隆表达技术获得重组多表位蛋白,研究其免疫特性,以筛选出有效的多表位串联肽,为研制拟态弧菌多表位疫苗奠定基础。首先,应用DNAStar软件,联合采用多种不同方法综合分析拟态弧菌外膜蛋白OmpU的二级结构、柔性区域、亲水性、表面可能性和抗原指数,筛选其优势B细胞表位。7个优势B细胞表位以丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(AAY)接头进行不同顺序串联组合,优化设计2个多表位串联基因(ompUepis和ompU2epis)。委托上海生物工程技术服务有限公司合成多表位串联基因ompUepis并构建重组质粒pUC57-OmpUepis。以pUC57-OmpUepis为模板,通过PCR方法获得pUC57-OmpU2epis(即2拷贝OmpUepis)。其次,分别将ompUepis和ompU2epis基因亚克隆至融合表达载体pAML-c4x中并进行原核表达。根据pAML-c4x阅读框的要求,设计合成3对特异性引物,以pUC57-OmpUepis为摸板,依次经PCR扩增、酶切和连接反应获得ompUepis和ompU2epis基因片段,并定向克隆至表达载体pAML-c4x中构建重组表达质粒pAML-c4x-OmpUepis和pAML-c4x-OmpU2epis。2个重组表达质粒转化至E.coli TB1,经IPTG诱导培养4h后,以可溶性形式分别表达了分子量约为52.4kDa和62.5kDa的重组多表位蛋白MBP-OmpUepis与MBP-OmpU2epis。最后,采用免疫印迹试验、间接ELISA试验和免疫保护性试验分析重组多表位蛋白的免疫特性。pAML-c4x-OmpUepis/TB1及pAML-c4x-OmpU2epis/TB1重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分离后电转移至PVDF膜,以兔抗MBP血清作为一抗,羊抗兔HRP-IgG为二抗进行免疫印迹分析,结果显示表达产物能与兔抗MBP血清发生特异性结合反应,表明MBP-OmpUepis及MBP-OmpU2epis具有免疫反应性。分别以重组多表位蛋白MBP-OmpUepis和MBP-OmpU2epis以及标签蛋白MBP免疫BALB/c小鼠,测定免疫小鼠血清中特异性抗体水平及其动态变化规律。结果发现MBP-OmpUepis免疫组和MBP-OmpU2epis免疫组小鼠在首次免疫后14d即可检测出特异性抗体,随着免疫次数和免疫时间增加,抗体水平不断提高,至免疫后第44天抗体水平达到最高峰,随后逐渐下降。表明重组蛋白MBP-OmpUepis和MBP-OmpU2epis均具有良好的免疫原性。免疫后第44天,用50 LD50拟态弧菌HX4株菌液(浓度为108 CFU/mL)人工感染各免疫组小鼠,结果显示MBP-OmpUepis免疫组和MBP-OmpU2epis免疫组小鼠的免疫保护率分别为90%和20%,MBP免疫组和生理盐水对照组小鼠全部死亡。表明重组多表位蛋白OmpUepis具有良好的免疫保护性。综上所述,重组多表位蛋白OmpUepis具有良好的抗原性和免疫保护性,在拟态弧菌多表位疫苗研制中具有应用价值。
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【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】