【摘要】： 目的: Alu和L1(long interspersed nuclear element 1,长散布重复序列1)两种重复序列占人类基因组DNA的27%,研究其调节基因表达的机理对于认识非编码序列的生物学作用,了解人类基因组结构的功能有重要意义。实验研究和基因组学分析显示L1与基因表达下调有关;在容易失活的基因、等位排斥基因及其侧翼存在较多的L1序列,比如免疫细胞的B细胞受体基因,T细胞受体基因,细胞因子中的白介素2基因等。多数实验显示Alu下调基因表达,基因组分析和少数实验数据提示Alu可以促进基因表达,在人类基因组中Alu元件可以散在分布也可以串联分布;在基因组中L1重复序列多数是不完整的序列,所以有必要研究串联Alu和L1片段对基因表达的影响。本文中将Alu或/和L1片段插入质粒报告基因下游,观察插入序列对报告基因转录量及转录终止的影响,再将SV40PolyA序列插入GFP基因下游,观察Alu和ORF2作为基因侧翼序列对基因表达的影响,并对Alu序列是否影响染色质构象进行研究。 方法:1表达载体构建合成带适当酶切位点的引物,PCR扩增pORF2质粒上的ORF2片段(L1第2读码框的1006bp-1285bp,称为280-4),酶切后插入pEGFP-C1质粒,获得pEGFP-280-4*1(p280-4*1),重复插入280-4构建出p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8,p280-4*14串联表达载体。 将酶切回收的280-4*1,280-4*2和280-4*4按正、反方向插入pAlu14的Alu14上游,获得六种质粒。 pORF2(L1-ORF2插入pEGFP-C1质粒),pAlu1, pAlu2,pAlu4,pAlu8,pAlu14(pEGFP-C1质粒GFP基因下游插入1,2,4,8或14个Alu),pA-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入PolyA正序),pAas-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入PolyA反序),pΔA-Alu14(pAlu14的Alu14上游插入去除AATAAA的PolyA正序),pΔAas-Alu14,pA-ORF2和pAas-ORF2为本研究室前期工作制备,本研究所用表达载体见表达载体一览表(Table 1)。 2细胞转染和荧光观察将表达载体用LipofectamineTM2000瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下计数观察GFP荧光阳性细胞数。 3 Northern杂交用PCR法制备32P标记的GFP探针。提取转染细胞总RNA,甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,将RNA转移到尼龙膜。32P标记的GFP探针杂交、冲洗后放射自显影。然后尼龙膜用剥离液处理,用检测neo RNA的探针再次杂交,放射自显影作为对照。 4 DNaseⅠ消化敏感性PCR扩增需要完整的模板,经DNaseⅠ切断的模板不再能被PCR扩增,开放的染色质对DNaseⅠ消化敏感,而缠绕的染色质对DNaseⅠ相对抵抗,所以DNaseⅠ消化后,用PCR扩增染色质的一定区段可以约略估计该区域的染色质包装状态。pAlu1和pAlu14转染细胞提取细胞核,用DNaseⅠ消化1分钟或3分钟时间,终止反应后作为PCR模板,使用四对引物分别扩增GFP基因和融合基因。 结果:1重组质粒鉴定构建质粒经核酸内切酶酶切分析,PCR分析和测序后可知,重组质粒中所插入的片段与预期长度一致,核苷酸序列正确无误。Fig.2为280-4串联表达载体酶切电泳图;Fig.3为p280-4*2测序图及序列。Fig.4为280-4*1,*2,*4正、反方向插入pAlu14表达载体的酶切电泳图和PCR电泳图。酶切,PCR和测序结果与设计要求和参照序列一致。 2 Alu和280-4串联序列对GFP基因表达的影响质粒瞬时转染HeLa细胞,p280-4*1,p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8,p280-4*14和pEGFP-C1荧光细胞阳性率值分别为:(4.7±1.30)%,(2.5±0.30)%,(1.8±0.30)%,(0.5±0.30)%,(0.1±0.30)%和(35.3±2.66)%。随着280-4片段插入数目增加荧光阳性细胞逐渐减少,p280-4*1荧光阳性细胞率是p280-4*14的47倍(Fig.5)。pAlu1, pAlu2, pAlu4, pAlu8和pAlu14转染HeLa细胞的荧光阳性率已另文报道。 Alu和280-4不同插入个数的串联序列质粒和pEGFP-C1质粒转染HeLa细胞,提取RNA,Northern杂交检测显示,随Alu插入片段增加,转录物长度增加,转录量减少。计算pEGFP-C1/pAlu1,pAlu1/pAlu2,pAlu2/pAlu4,pAlu4/pAlu8和pAlu8/pAlu14转录相对量的比值分别是:1.18,1.14,1.39,1.58和55.5,可见从pAlu8到pAlu14发生了更加明显的抑制作用。p280-4*1,p280-4*2,p280-4*4,p280-4*8和p280-4*14质粒Northern检测结果为:随插入片段增加,转录物长度增加,转录量减少,抑制程度超过Alu插入(Fig.6)。 3 SV40Poly解除抑制将PolyA及去除AATAAA核心序列的PolyA按正、反方向插入pAlu14质粒的Alu14上游,使Alu14成为基因侧翼,均可以部分解除Alu14对GFP基因表达的抑制作用,PolyA反序解除抑制的能力高于其正序,去除AATAAA核心序列的PolyA解除抑制作用基本不变,而且仍然发生转录终止;PolyA正、反序列同样解除ORF2对GFP基因的抑制作用(Fig.7)。 4 280-4与Alu混合排列对GFP基因表达的作用pAlu14质粒Alu14前按正、反方向插入1,2,4个280-4,随着插入片段的增大,转录减少,插入反序280-4转录多于正序。280-4串联序列反方向插入pEGFP-C1质粒,GFP基因转录多于正序插入,在pAlu14的Alu14的上游插入280-4观察到类似的现象(Fig.8)。 5 DNaseⅠ消化敏感性pAlu1和pAlu14转染HeLa细胞,提取细胞核,DNaseⅠ消化,分别用四对引物扩增,扩增长度分别为:GFP5F/GFP4R(215bp),GFP2/GFP3(311bp),1GFP1F/Alu2(460bp)和ECor-xba/Alu2(340bp)。pAlu14消化1分钟可扩增出特异条带,消化3分钟无扩增条带,而pAlu1转染细胞核,两个消化时间均无扩增条带,显示pAlu14的GFP基因和融合基因对DNaseⅠ消化的抵抗性高于pAlu1(Fig.9)。 结论:1 Alu越长抑制上游GFP基因的能力越强。 2 Alu属于转录延伸序列,不发生提前终止。 3 L1-ORF2-280-4也属于转录延伸序列,但是转录作用比Alu弱,不发生提前终止。 4 Alu14和ORF2上游插入PolyA正、反和去除AATAAA的PolyA正、反,使Alu14和ORF2作为基因侧翼序列,对GFP基因的抑制作用明显减弱,且不受PolyA正、反序列和去除AATAAA信号的影响。 5 Alu和280-4串联显示,280-4越长,抑制作用越强。 6 Alu14抑制上游GFP基因表达与染色质包装有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R394
【共引文献】
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本文编号：
2414655
