抗神经导向因子netrin-1受体-UNC5B单克隆抗体的制备和功能研究

发布时间：2019-01-26 12:46

【摘要】：研究背景：神经系统作为一个神奇而复杂的组织，无论在其解剖结构还是生物学方面都存在精细的调控环节。2013年美国政府宣布投入1亿美元用于大脑研究，试图解决迄今无法解决的难题：为人类大脑行动路线做记录并制图，显示“百万大脑细胞是如何互动的”。其重要研究内容就包括了：测量关于单个神经细胞是如何工作的，信息在神经细胞之间是如何传递的，以及当产生记忆时神经细胞之间的联系是如何得到加强和减弱的。而神经导向因子能够在神经元发育和信息传递过程中发挥调控作用，能够引导神经细胞定向生长，为神经系统复杂网络结构和特异的传导功能提供解剖和生理基础；因此，它成为大家研究的热点问题。神经导向因子netrin-1是最早发现的可溶性神经导向因子，在许多物种的神经系统中都有高表达。在神经发育过程中，神经生长因子netrin-1通过与结肠直肠癌缺失蛋白（deleted in colorectal cancer, DCC）和UNC-5同源蛋白(uncoordinated-5homolog, UNC5H)两大受体家族结合发挥作用。其中，UNC5B（Uncoordinated-5homolog B receptor）与netrin-1结合在神经细胞发育中发挥负向调控作用；这种作用与DCC受体参与的正向调控作用协调，共同促进生长锥生长使轴突延长，引导其生长方向。近些年的研究还表明，netrin-1和UNC5B在很多肿瘤中表达异常，可能在肿瘤的发生过程中扮演重要角色。为了进一步深入探讨UNC5B在肿瘤中的表达及其相关功能，制备了UNC5B单克隆抗体。本研究选择性的选取UNC5B基因胞外区的两个免疫球蛋白区域（Ig domain）进行抗体制备。由于该区域能够与配体netrin-1结合，通过激活下游信号发挥生物学功能。因此用该片段免疫小鼠制备的单克隆抗体，不仅能够与UNC5B结合，还具有其他的生物学活性。目的：本研究旨在应用单克隆抗体技术，制备能够识别UNC5B蛋白的单克隆抗体，用以探讨UNC5B与肿瘤转移的关系。并在食管癌组织中探讨了UNC5B的表达，为以后相关研究提供基础。方法：（1）首先体外扩增UNC5B基因胞外端序列，将该序列插入带有His标签的原核表达载体pET-32a中进行原核表达。分析原核表达产物的可溶性，进行规模化表达。（2）利用GE Healthcare公司Glutathione Sepharose4B纯化说明书，纯化UNC5B重组蛋白；利用Nano drop测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色分析蛋白纯度。（3）经传统单克隆抗体技术，制备UNC5B单克隆抗体；然后以商品化UNC5B多抗为对照，用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白印迹（Western Blot）、免疫荧光（Immunoflourescence）和流式细胞（Flow Cytometry）方法验证单克隆抗体与UNC5B的特异性结合能力。（4）细胞迁移能力分析：细胞划痕实验能够模拟体外细胞致伤愈合的修复过程，根据培养基中添加UNC5B单克隆抗体及其配体netrin-1后细胞迁移长度的变化，分析该化合物对细胞损伤愈合的影响；transwell实验模拟体内细胞迁移的原理，根据上、下小室营养成分趋化细胞迁移数量的不同，分析其对细胞迁移的影响。（5）细胞增殖实验（CCK-8assay）检测netrin-1和UNC5B单抗对肿瘤细胞增殖能力的影响。（6）收集食管癌病人病理标本，免疫组化技术探讨UNC5B在食管癌上的表达。结果：原核表达了带His标签的UNC5B融合蛋白，5000r/min收集细菌，超声破碎，SDS-PAGE电泳分析，在裂解后上清中有一50kDa的蛋白，与预期大小一致。说明蛋白主要为分泌型。所以大量诱导细菌，经Glutathione Sepharose4B纯化蛋白，SDS-PAGE电泳分析，该纯度能够用于免疫小鼠。利用传统的单克隆抗体技术，经间接ELISA成功筛选出一株抗体2C9，抗体效价较高为1:32,000。然后用ELISA、WesternBlot、Immunoflourescence和Flow Cytometry方法验证单克隆抗体能够识别转染后的UNC5B和天然UNC5B蛋白，该抗体具有免疫结合的特异性。另外，我们利用2C9检测到黑色素瘤细胞A375细胞表面有UNC5B表达。利用细胞划痕和transwell实验检测了2C9对A375细胞迁移的影响。实验结果说明，netrin-1能够抑制黑色素瘤细胞A375的迁移，与空白对照组存在显著性差异（P0.01）；另外，2C9能够逆转netrin-1对细胞迁移的抑制作用，与netrin-1对照组存在显著性差异（P0.01）。并且，此处理条件对细胞增殖无影响（P0.05）。最后，根据病理资料和标本完整性，选取三个食管癌病人。免疫组化结果发现，食管癌组织中有UNC5B表达，，且高于正常组织。结论：（1）利用pET-32a原核表达载体，成功表达了UNC5B胞外端的融合蛋白；（2）利用杂交瘤技术成功制备了一株效价高、特异性好的UNC5B单克隆抗体2C9。该抗体具有抗原识别特异性，能用Western Blot、免疫荧光和流式细胞技术检测UNC5B表达情况。同时发现黑色素瘤细胞A375细胞表面有UNC5B表达。（3）细胞划痕（wound healing）和transwell实验均证明，netrin-1能抑制A375细胞的迁移；但同时加入2C9后，不但不能抑制迁移，与加netrin-1实验组相比，反而促进了细胞迁移。CCK-8检测细胞增殖能力，结果该实验条件对细胞增殖亦没有影响。为此我们推测，可能是细胞表面netirn-1不同受体的竞争结合作用。该研究结果为下一步探讨netrin-1、UNC5B参与肿瘤细胞迁移的相关机制奠定基础。（4）免疫组化分析人食管癌组织中UNC5B存在高表达，为进一步研究UNC5B表达与临床指标的相关性提供基础。
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【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】