人巨细胞病毒IE1核酸疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

发布时间：2019-02-23 15:07

【摘要】： 目的:构建人巨细胞病毒(HCMV)IE1核酸疫苗pcDNA3.1(-) -IE1,通过免疫BALB/c小鼠,初步研究其产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为进一步研发HCMV IE1疫苗奠定实验基础。 方法: (1)将重组载体pEGFP-C1-IE1用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切与载体pcDNA3.1(-)连接构建重组质粒pcDNA3.1(-)-IE1,双酶切鉴定。 (2)将重组质粒pcDNA3.1(-)-IE1转染HeLa细胞,RT-PCR及Western blot测定IE1在真核细胞的表达。 (3)将pcDNA3.1(-) -IE1、对照空质粒pcDNA3.1(-)及PBS分别通过肌肉注射8 w龄BALB/c小鼠,隔2 w免疫1次,共免疫4次。 (4)末次免疫小鼠2 w后,取小鼠肌肉组织通过PCR法检测IE1基因,免疫组化测定IE1基因在小鼠肌细胞中的表达。 (5)末次免疫小鼠2 w后,无菌制备小鼠脾细胞,经PHA刺激后,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-2、IFN-γ含量;MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,计算刺激指数(SI)。用统计软件SPSS13.0分析实验数据。 结果: (1)构建的真核细胞表达载体pcDNA3.1(-)-IE1经双酶切后,小片段约1476 bp,与IE1大小一致。 (2) pcDNA3.1(-)-IE1转染HeLa细胞后,RT-PCR检测到约1476 bp片段,与IE1大小相符,Western blot检测到分子量约72 kDa的IE1蛋白。 (3)在免疫小鼠肌细胞中,利用PCR检测到约1476 bp片段,与IE1大小一致,即IE1基因在小鼠肌细胞中稳定存在;免疫组化结果显示IE1基因在小鼠肌细胞中表达IE1目的蛋白。 (4)核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激后,培养上清液中:IL-4含量为30.47±1.76 pg/mL,与空质粒组(26.88±2.60 pg /mL)和PBS组(25.06±2.60 pg /mL)比较差异有显著性(P 0.05);IL-2含量为47.98±2.08 pg/mL,与空质粒组(19.66±2.45 pg/mL)和PBS组(16.06±2.45pg /mL)比较差异有显著性(P 0.01);IFN-γ含量为50.47±4.81 pg/mL,与空质粒组(28.24±4.18 pg/mL)和PBS(25.06±4.35 pg /mL)组比较差异有显著性(P 0.001)。 (5)核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激后,SI为3.55±0.48,与空质粒组(1.86±0.23)和PBS组(1.48±0.11)比较差异有显著性(P 0.001)。 结论: (1)成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-IE1,且其能在真核细胞内表达HCMV IE1蛋白。 (2) pcDNA3.1(-)-IE1核酸疫苗能在BALB/c小鼠肌细胞中稳定存在,并且能在其肌细胞中表达HCMV IE1蛋白。 (3) pcDNA3.1(-)-IE1核酸疫苗可诱导BALB/c小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-2、IFN-r和刺激BALB/c小鼠脾细胞增殖。
[Abstract]:Objective: to construct a human cytomegalovirus (HCMV) IE1 nucleic acid vaccine pcDNA3.1 (-)-IE1, by immunizing BALB/c mice to study its humoral and cellular immune responses. To lay the experimental foundation for further research and development of HCMV IE1 vaccine. Methods: (1) Recombinant plasmid pcDNA3.1 (-) -IE1, was digested with EcoR 鈪，

本文编号：2428941