非p53、非caspase条件下Cr（Ⅵ）诱导细胞凋亡机制的初步探讨

发布时间：2019-02-25 13:06

【摘要】： 目的:在体外试验系统,初步探讨Cr(Ⅵ)在P53缺失且caspase抑制条件下诱导Hep3B细胞的凋亡机制,进一步阐明ROS在其中的作用。 方法:以Hep3B细胞为受试细胞,通过MTT试验检测不同浓度下Z-VAD-fmk、NAC、Cr(Ⅵ)对Hep3B细胞存活率的影响,通过单细胞凝胶电泳实验观察细胞凋亡形态筛选出有效的Cr(Ⅵ)作用时间。其后续试验Cr(Ⅵ)浓度定为20μmol/L,染毒时间为6h。将Hep3B细胞随机分成对照组、Cr(Ⅵ)处理组、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)处理组、NAC+Cr(Ⅵ)处理组、Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)处理组。Z-VAD-fmk和NAC分别预处理细胞1h,再加入K_2Cr_2O_7至终浓度20μmol/L,染毒6h。姬姆萨染色、电镜观察及单细胞凝胶电泳法观察细胞凋亡形态及细胞DNA损伤情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率,荧光分光光度法检测线粒体通透性转运孔(PTP)及跨膜电位(△ψm)、化学比色法检测细胞氧化损伤。 结果: 1.Cr(Ⅵ)引起Hep3B细胞存活率降低:Cr(Ⅵ)在2.5-100μmol/L处理浓度范围内,能明显引起Hep3B细胞存活率的降低(P＜0.05),处理浓度和细胞存活率之间存在负相关(r=-0.893)。 2.染毒处理导致DNA损伤:与对照组相比,Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)处理组能明显诱导细胞DNA链断裂,彗星数量增多(P＜0.05);NAC+Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)处理组,与Cr(Ⅵ)处理组相比DNA损伤程度减轻(P＜0.05)。 3.染毒处理对Hep3B细胞形态学的影响:Cr(Ⅵ)处理6h,引起Hep3B细胞皱缩或肿大,染色质浓染,细胞间隙扩大,空泡样变,细胞膜和核膜不完整或消失,染色质嗜碱性降低。电镜下观察,可发现Cr(Ⅵ)染毒组细胞出现表面微绒毛减少,线粒体肿胀、嵴消失、空泡状变,细胞核内出现透亮区、呈空泡状变等细胞凋亡或坏死的表现。加入NAC有保护作用。 4.染毒处理对Hep3B细胞凋亡的影响:与对照组相比,Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)处理组能明显诱导Hep3B细胞细胞发生凋亡和坏死(P＜0.05);NAC有明显保护作用(P＜0.05)。 5.染毒处理导致Hep3B细胞线粒体膜损伤:与对照组相比Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)处理组细胞线粒体膜电位(△ψm)降低,PTP开放度增加,差异有显著性(P＜0.05)。加入NAC后有明显的拮抗作用(P＜0.05)。 6.染毒处理导致细胞氧化损伤:Cr(Ⅵ)、Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)、NAC+Cr(Ⅵ)和Z-VAD-fmk+NAC+Cr(Ⅵ)染毒组引起SOD、CAT、GR活性明显降低,NO、MDA生成增多,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05);加入NAC后有明显保护作用(P＜0.05)。 结论:20μmol/L Cr(Ⅵ)能明显引起Hep3B细胞氧化应激,导致细胞DNA损伤、线粒体膜损伤、细胞凋亡等;同时在抑制caspase条件下,受试细胞仍然发生凋亡。结果提示,Cr(Ⅵ)诱导的凋亡可能存在非p53、非caspase途径,其中ROS起重要作用。
[Abstract]:Aim: to investigate the mechanism of Cr (鈪，

本文编号：2430204