氨基葡萄糖硫酸盐诱导K562细胞凋亡中Cathepsin D与Bcl-X_L的作用研究

发布时间：2019-02-26 19:11

【摘要】： 研究背景细胞是机体最基本的结构和功能单位,在机体代谢过程中相互协调,其中细胞凋亡(apoptosis)对于调节组织发育和内稳态有重要作用。细胞凋亡是细胞死亡的一种形式,一种基本的生命现象,参与机体的生长发育及衰老等多种生理过程,同时也是参与包括肿瘤在内的多种疾病的发病机制的重要因素。细胞凋亡信号转导及分子调控机制一直是生命科学研究领域包括肿瘤在内的许多疾病发生发展过程中的一个非常重要的基本问题。虽然目前凋亡信号转导的主要途径已经明确,溶酶体是介导细胞凋亡的重要结构,且在不同诱导因素引发凋亡时,其凋亡信号转导的途径存在差异,但在多种诱因下溶酶体与线粒体之间凋亡信号转导的具体机制尚未明确。本实验是在前期研究的基础上进行的,既往我们发现氨基葡萄糖硫酸盐(Glucosamine Sulfate,GS)可以诱导K562细胞凋亡,并且这种凋亡是通过溶酶体途径释放Cathepsin D( Cat D)介导的,而且与Bcl-XL的下调相关联,但是Cat D信号是如何从溶酶体转移到线粒体,与线粒体表面上的凋亡抑制蛋白Bcl-XL又有何种关系还不得而知。为明确在细胞凋亡中溶酶体释放Cat D与线粒体外膜Bcl-XL有无相互作用的基础,Bcl-XL是否为溶酶体Cat D与线粒体间凋亡信号转导新路径的下游底物分子,我们进行了它们的作用机制研究。目的建立氨基葡萄糖硫酸盐(Glucosamine Sulfate,GS)诱导慢性髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML) K562细胞凋亡的模型,用含5.0 mmol.L-1GS诱导K562细胞,应用免疫荧光、Western Blot、RNA干扰等方法检测溶酶体释放的Cat D与线粒体外膜上Bcl-XL的变化,探讨在K562细胞凋亡模型中,Cat D与Bcl-XL作用机制。方法 1.慢性髓性白血病K562细胞凋亡前后,MTT法检测细胞凋亡前后的细胞活性;凋亡前后K562细胞HE染色、Hoechst33342检测细胞形态变化;应用DNA ladder检测细胞的凋亡情况;应用流式细胞仪检测诱导后细胞状态。 2.应用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光双标记、Western blot方法检测凋亡前后及应用Pepstatin A抑制Cat D前后细胞内的Cat D与Bcl-XL的相互作用机制。 3.购买的SANTA公司的特异性Cat D和Bcl-XL的小干扰RNA及阴性RNA。通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染K562细胞,倒置显微镜下观察细胞形态、免疫荧光双标染色后的激光共聚焦成像、反转录PCR检测转染后再用GS处理前后48h后Cat D和Bcl-XL mRNA表达;利用免疫印迹技术测定细胞转染siRNAs后,GS处理前后的Cat D和Bcl-XL的蛋白质表达情况; 结果 1.0.5 mmol.L-1、1.0 mmol.L-1、5.0 mmol.L-1的GS诱导均有细胞抑制作用,5.0 mmol.L-1的GS抑制性最强。HE染色对照组K562细胞呈圆形,边界光滑,胞膜无皱缩,而5.0 mmol.L-1 GS处理72 h后,细胞皱缩,胞膜不光滑,出现空泡现象并且细胞有出芽现象。5.0 mmol.L-1 GS处理72 h后Hoechst33342染色显示出凋亡细胞存在。5.0 mmol.L-1 GS处理72 h后DNA ladder的电泳图片上出现180-200bp明显条带;在流式细胞仪检测中对照的K562细胞,也有少许凋亡,为肿瘤细胞的自发凋亡,而经过5.0 mmol.L-1 GS诱导72 h后的K562细胞,凋亡明显增多。与未处理的K562细胞相比5.0 mmol.L -1 GS诱导72 h后凋亡率由3.8 %变成12.4 % ,P0.05,。 2.经过5.0 mmol.L-1 GS诱导72 h后的K562细胞,Cat D与Bcl-XL的激光共聚焦信号明显增强,Cathepsin D蛋白表达增加,而Bcl-XL蛋白表达减少。K562细胞经用Pepstatin A处理,再用5.0 mmol.L-1 GS诱导72 h较GS处理组的Cat D的表达减弱,Cat D与Bcl-XL的共定位信号较处理前的信号明显增强,Cat D蛋白表达减少,而Bcl-XL蛋白表达则没表现出明显差异。 3.脂质体转染干扰RNA后免疫荧光双标的激光共聚焦显示:分别转染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA组的K562细胞,被转染抑制的信号在共定位的信号中明显减弱。5.0 mmol.L-1 GS诱导72 h分别转染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA组中,Cat D与Bcl-XL的共定位信号CatD相对增强。与转染的K562细胞相比,GS诱导凋亡前后Cat D蛋白表达增加而Bcl-XL蛋白表达未见明显差异。结论 1.成功构建氨基葡萄糖硫酸盐诱导慢性髓性白血病的凋亡模型。5 mmol.L-1的GS诱导的K562细胞凋亡作用明显; 2.5 mmol.L-1的GS诱导的凋亡细胞Cat D与Bcl-XL的共定位信号明显增强。而Cat D蛋白表达增加,Bcl-XL蛋白表达减少。在Pepstatin A抑制Cat D后,再用5 mmol.L-1的GS诱导与单纯的5 mmol.L-1的GS诱导的K562细胞,可以看出在Pepstatin A抑制后,Cat D与Bcl-XL的共定位信号中显现Cat D的信号增强。Cat D蛋白表达减少,而Bcl-XL蛋白表达则没表现出明显差异。 3.脂质体转染干扰RNA Cat D与Bcl-XL后两者的共定位信号减弱。干扰Cat D后,Cat D与Bcl-XL的共定位信号表现为Cat D的表达减弱而Bcl-XL相对增强;干扰Bcl-XL后,Cat D的表达相对增强。干扰Cat D与Bcl-XL前后两者的蛋白表达均受抑制,而在5 mmol.L-1的GS诱导后,Cat D的表达增强,而Bcl-XL则没有明显变化。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

【参考文献】