炎症因子IL-23对小鼠骨髓来源巨噬细胞极化作用影响的实验研究

发布时间：2019-03-02 18:25

【摘要】：目的巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要组成成分,但其组织分布、分化程度以及外界激活因子的多样性赋予了巨噬细胞复杂的异质性与功能的多样性。在组织微环境中,巨噬细胞的激活会受到多种因素的影响。病原体的入侵、体内坏死的细胞及碎片、其它细胞分泌的因子等刺激,均可使巨噬细胞的吞噬能力、细胞因子及趋化因子分泌能力、抗肿瘤能力、对趋化因子做出应答以及对抗原的加工递呈能力等发生明显变化。本实验着重研究巨噬细胞对炎症因子刺激发生的表型变化,明确IL-23对经体外诱导建立的M2型骨髓来源巨噬细胞极化作用的影响。探讨在IL-23作用下,表型发生变化后的M2型巨噬细胞对黑色素瘤细胞体外增殖和侵袭的影响,为以巨噬细胞再极化为靶点的肿瘤免疫治疗提供实验依据与新思路。方法：体外分离培养C57BL小鼠骨髓来源巨噬细胞,分别加入诱导因子IL-4、M-CSF和B16F10非接触共培养建立三种M2型巨噬细胞模型,在此基础上,观察施加炎症因子IL-23干扰后,三种M2型巨噬细胞形态、分泌因子、细胞代谢和细胞表面标志物表达水平的变化：倒置显微镜下观察在不同细胞因子刺激下,巨噬细胞形态变化；ELISA技术检测三种M2型巨噬细胞分泌细胞因子表达情况,以及IL-23处理后分泌细胞因子表达水平的异同；Western blot技术检测三种M2型巨噬细胞精氨酸代谢相关酶类表达量,以及IL-23处理后表水平的变化；流式细胞术检测三种M2型巨噬细胞相关特异性细胞表面标志物表达量,以及IL-23处理后表达水平的变化。MTT增殖实验和Transwell实验检测IL-23处理后的M2型巨噬细胞上清对黑色素瘤B16F10细胞增殖能力和侵袭能力的影响。MTT增殖实验和Transwell实验检测IL-23对黑色素瘤B16F10细胞增殖能力和侵袭能力的影响。结果：第一部分：IL-23对M2型巨噬细胞表型的影响。三种M2型巨噬细胞模型经一定浓度IL-23处理后,细胞形态由纤维梭形向煎蛋样形态(M1型形态)转变；Elisa检测IL-23处理后三种M2型巨噬细胞分泌因子变化,由IL-10highIL-12lowTNF-αlow转变为IL-10lowIL-12highTNF-αhigh; Western Blot显示IL-23下调M2型巨噬细胞精氨酸酶(Arginase, Arg-1)的表达,同时上调诱导性一氧化氮合酶(Inducible nitric-oxide synthase, iNOS)的表达(P0.01),精氨酸代谢向M1型方向转化；流式细胞术分析显示IL-23下调M2巨噬细胞特异表面标志物CD206(P0.01),并上调CD16/32(P0.05)和MHC-Ⅱ(P0.01)的表达。综上,经IL-23处理后,三种M2型巨噬细胞的细胞形态、分泌因子种类、细胞代谢和细胞表面标志物表达水平均表明细胞已向M1型转化,其是否对肿瘤细胞具有杀伤作用有待下一步研究。第二部分：IL-23处理后M2型巨噬细胞对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体外增殖、侵袭能力的影响。根据第一部分实验结果,收集对照组M2型巨噬细胞和实验组(IL-23处理组)巨噬细胞上清,并设置单纯血清为空白组检测其对黑色素瘤细胞B16F10增殖的影响。改良Transwell实验检测其对黑色素瘤细胞B16F10侵袭能力的影响。实验结果表明：MTT细胞增殖实验显示与单纯血清组相比,M2型巨噬细胞可促进肿瘤细胞的增殖,IL-23处理过后的M2型巨噬细胞上清抑制B16细胞增殖(P0.05),这一效应与TNF-α的分泌相关；改良Transwell侵袭实验显示IL-23处理过后的M2型巨噬细胞与对照组相比,穿入下室细胞数显著减少(P0.01)。提示IL-23在改变巨噬细胞表型的同时,也恢复了M1型巨噬细胞的抗肿瘤免疫特性。第三部分：IL-23对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体外增殖、侵袭的影响多数细胞因子以自分泌形式发挥效应,即主要作用于产生细胞本身和(或)临近细胞,在局部发挥效应。其生物功能除参与免疫调节外,可直接作用于肿瘤细胞自身,调节肿瘤细胞的增殖与侵袭。本部分选择炎症因子IL-23和黑色素瘤B16F10细胞进行体外实验研究,通过培养肿瘤细胞,施加IL-23影响,观察其对B16F10细胞增殖、侵袭能力的直接作用。实验结果表明：与对照组相比,IL-23处理组B16F10细胞穿膜数明显增多(P0.01)；肿瘤细胞MMP-2和MMP-9的表达活性增强(P0.01)；B16细胞的增殖能力未见明显变化。结论本研究通过体外建立三种M2型巨噬细胞模型,应用Elisa、Western Blot、以及流式细胞术等技术,观察炎症因子IL-23对其表型变化的影响,并通过体外实验观察转变后巨噬细胞对肿瘤细胞的影响,主要结论如下： 1、IL-23可促进M2巨噬细胞向M1型转化,本实验中的具体表型为TNF-αhighIL-12highIL-10low, iNOS高表达,CD16/32和MHC-Ⅱ表达阳性细胞比例升高。 2、IL-23处理过后的M2型巨噬细胞可分泌具有细胞毒性的介质(’TNF-α、NO等)抑制B16F10细胞的增殖,并在体外实验中表现为抑制肿瘤细胞的侵袭。 3、IL-23对黑色素瘤B16F10细胞的增殖能力无影响,可通过上调MMP-9的活性促进肿瘤细胞侵袭。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392

【参考文献】