大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导培养后Cx40及HCN4的表达

发布时间：2019-03-17 14:28

【摘要】：目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)与窦房结(sinoatrial node, SAN)组织块混合诱导培养后Cx40及HCN4的表达情况,探讨大鼠骨髓间充质干细胞向窦房结细胞分化的可能性。方法：(1)大鼠骨髓间充质干细胞的取材：将健康SD大鼠用75%酒精直接浸泡处死,无菌条件下解剖出股骨、胫骨。用PBS液冲洗股骨、胫骨骨髓腔,离心管收集富含骨髓间充质干细胞的细胞悬液。(2)大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养：将富含骨髓间充质干细胞的细胞悬液离心,吸去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液制成细胞悬液,接种于细胞培养瓶。采用贴壁筛选法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,置于37℃含5%CO2的恒温孵箱中培养,待细胞融合接近80%时用0.25%的胰蛋白酶消化、传代。(3)MSCs的纯度及活性鉴定：采用细胞免疫荧光法,利用CD34、CD44抗体鉴定传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞纯度,同时用台盼蓝染色鉴定第3代大鼠骨髓间充质干细胞的活性。(4)接种MSCs:取经过纯度和活性鉴定的第3代MSCs细胞,用荧光染料CFSE(5, 6-carboxyfluorescein diacetate, N-succinimidyl ester)标记,以确保实验的细胞是来源于第3代MSCs,然后以相同的细胞浓度(1×105/ml)分别接种于六孔培养板的培养孔内,或者培养孔内的盖玻片上制成细胞爬片。(5)大鼠窦房结组织的取材：用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，，无菌条件下取出SD大鼠心脏,PBS液反复冲洗。于右心房窦房结区域选取窦房结组织,剪成约0.3cm×0.3cm大小的组织块,立即置入4℃无菌的PBS液中。(6)混合培养：将组织块分别置入培养孔的边缘与大鼠MSCs混合培养,但不与MSCs直接接触。(7)分组：对照组(A组)：单独培养大鼠MSCs1周；实验组：将大鼠MSCs与窦房结组织块混合培养,分别诱导培养1周(B组)、2周(C组)和3周(D组)。(8)筛选细胞：培养结束后,于荧光显微镜下筛选出各组中CFSE标记率较高(90%)且分布均匀的细胞,以保证被用来检测的细胞系来源于第3代MSCs,分别做Cx40和HCN4的检测。(9)细胞Cx40及HCN4的MIOD检测：75%酒精固定细胞爬片,采用免疫组织化学的方法(SP法)染色,运用Image-pro plus 5.0图像分析软件鉴定各组细胞表达Cx40和HCN4的平均积分光密度值(mean integrated optical density, MIOD)值。(10)细胞Cx40及HCN4的mRNA检测：采用实时荧光定量PCR (Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-PCR)的方法,检测各组细胞中Cx40、HCN4的mRNA表达水平。(11)统计分析：实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析,组间比较采用方差分析的方法。结果：(1)采用细胞免疫荧光法鉴定实验分离、培养、纯化的第3代MSCs,在每荧光显微镜视野下MSCs占80%以上；同时用台盼蓝染色判定MSCs的活性在90%以上。(2)实验组细胞Cx40、HCN4的MIOD值都比对照组高,即实验组细胞Cx40、HCN4的表达比对照组强,差异有统计学意义(p＜0.01)；且随着混合培养时间的延长,Cx40及HCN4的表达逐渐增加,实验组间差异均有统计学意义(p0.05)。(3)实验组细胞Cx40、HCN4的mRNA表达水平都比对照组高,差异有统计学意义(p＜0.01)；并且培养时间越长,Cx40及HCN4的mRNA表达越明显,组间差异均有统计学意义(p0.05)。结论：(1)本实验采用的大鼠MSCs的取材、以及贴壁法分离、培养细胞的方法可靠,细胞传至第3代后能获得活性和纯度均较高的MSCs。(2)将大鼠MSCs与窦房结组织块体外混合培养,诱导后细胞Cx40及HCN4高表达。(3)大鼠MSCs经过与窦房结组织块体外混合培养后,具有向窦房结细胞分化的可能。
[Abstract]:Objective: To study the expression of Cx40 and HCN4 in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), and to explore the possibility of the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells into the cells of the rat. Methods: (1) The rat bone marrow mesenchymal stem cells were obtained: the healthy SD rats were directly soaked and killed with 75% alcohol, and the femur and the tibia were dissected under sterile conditions. The femur, the tibial bone marrow cavity, and the centrifuge tube were washed with PBS to collect the cell suspension rich in the bone marrow mesenchymal stem cells. (2) separating and culturing the rat bone marrow mesenchymal stem cells, centrifuging the cell suspension rich in the bone marrow mesenchymal stem cells, sucking the supernatant, adding the DMEM high-glucose culture solution containing 10% fetal bovine serum to prepare the cell suspension, and inoculating the cell culture bottle. The bone marrow-derived mesenchymal stem cells were isolated and purified in a constant-temperature incubator containing 5% CO2 at 37 鈩

本文编号：2442389