携带4-1BBL基因的胃癌细胞总RNA转染树突状细胞疫苗的体内实验研究

发布时间：2019-03-21 17:40

【摘要】： 目的:恶性肿瘤其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫逃逸有关。人体的抗肿瘤免疫是以T细胞介导的细胞免疫为主,T细胞的活化需双信号刺激:第一信号由T细胞抗原受体(TCR)与抗原提呈细胞(APC)上的抗原肽MHC分子复合物结合提供,第二信号由APC上的共刺激分子与T细胞上的相应配体提供,只有双信号共同刺激才能有效激活特异性的T细胞,完成细胞免疫,消灭肿瘤细胞。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免疫。目前认为树突状细胞(dendritic cell DC)是效率最高,最具潜能的抗原提呈细胞(APC),在诱导、调节、维持机体抗肿瘤免疫中起核心作用,其独特功能表现在识别和吞噬病原体,将大分子抗原加工成肽段,刺激未致敏T细胞产生特异性免疫应答。用带着肿瘤抗原的DC诱导机体抗肿瘤免疫是颇具潜力的免疫治疗方法。近年来,以树突状细胞为基础的肿瘤免疫报道很多,研究报道,DC疫苗在部分恶性肿瘤的治疗中显示出良好的效果。 4-1BB和4-1BBL是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号,在免疫应答、肿瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用。4-1BB/4-1BBL在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、T细胞共刺激以及信号传导中起不同的作用。4-1BB和其配体4-1BBL介导的共刺激信号是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的,有望为肿瘤生物治疗开拓新的途径。本实验研究把共刺激分子4-1BBL基因导入胃癌细胞,再提取此胃癌细胞的总RNA转染DC,制备肿瘤疫苗,观察其体内的抗肿瘤效应。为以DC为基础的胃癌免疫治疗提供新的策略,同时为进一步应用于临床奠定理论基础。方法: 1用脂质体法把pMKITneo/4-1BBL基因导入615小鼠胃癌细胞MFC内,G418筛选阳性克隆而成为MFC/4-1BBL细胞。 2逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定转染细胞中4-1BBL基因mRNA的存在。 3自615小鼠骨髓组织中分离树突状细胞(DC),并进行体外培养使之进一步增量和成熟。 4用脂质体包裹MFC/4-1BBL细胞总RNA转染小鼠树突状细胞,制备DC/4-1BBL/RNA疫苗。 5取615小鼠,均接种MFC细胞,建立荷瘤小鼠胃癌模型。随机分为对照组、DC组、DC/MFC组和DC/MFC/4-1BBL组。用疫苗皮下注射治疗。观察其肿瘤生长情况和免疫状态。所有实验数据用SPSS 13.0统计软件处理,P0.05时认为差异具有显著性。结果: 1 pMKITneo/4-1BBL质粒酶切鉴定抽提所得质粒用XhoI、NotI酶切,证实pMKITneo/4-1BBL质粒有927bp片断脱落;pMKITneo表达载体质粒变为约5.8kb线性化载体,与理论值相符,证明pMKITneo/4-1BBL质粒正确存在并被成功扩增,同时也证实其为重组克隆。 2 4-1BBL基因转染MFC细胞后的鉴定小鼠胃癌细胞株MFC经脂质体法转染4-1BBL基因、G418筛选后,均获得了阳性克隆,称为MFC/4-1BBL。用MFC/4-1BBL细胞提取总RNA,反转录合成cDNA,再以小鼠4-1BBL的特异性引物进行PCR扩增,可得到616bp的特异性条带,证实有4-1BBL的mRNA较强表达,而未转染4-1BBL基因的MFC细胞则有较弱的4-1BBLmRNA的表达。 3骨髓来源的DC的制备及细胞表型鉴定小鼠骨髓单核细胞在含10%FBS、rmGM-CFS和rmIL-4的培养体系中培养至第七天即分化成形态正常的DC。采用流式细胞仪进行DC表型分析,CD11c阳性表达可达80%以上。 4肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的生长情况及免疫状况的影响 4.1荷瘤小鼠一般状况正常615小鼠活动力强,反应迅速,正常觅食;肿瘤细胞接种两周后,各组小鼠活动力均下降,反应迟钝,食欲减退,尤以对照组和DC组小鼠显著。末次免疫后一周处死小鼠,各组小鼠的肿瘤组织位于皮下生长,与周围组织稍有粘连,包膜完整,较易剥离,质软,瘤体表面密布增生血管。 4.2各组小鼠肿瘤瘤重和抑瘤率的比较比较各组瘤体重量由高到低为对照组(3.82g±0.57)、DC组(3.63g±0.51)、DC/MFC组(2.67g±0.32)、DC/MFC/4-1BBL组(2.06g±0.39)。DC/MFC/4-1BBL组的平均瘤重最低,与其它各组比较均有统计学差异(P 0.05),且抑瘤率最高,抑瘤效果最好; DC/MFC组平均瘤重显著小于对照组(P 0.05),其抑瘤率明显高于DC组; DC组的平均瘤重小于对照组,但二者之间差异无统计学意义(P 0.05)。 4.3各组小鼠肿瘤组织凋亡率的比较对荷瘤615小鼠的胃癌组织用流式细胞术测定其细胞凋亡情况,发现其凋亡率由高到低为DC/MFC/4-1BBL组(28.58%±2.84)、DC/MFC组(25.03%±1.88)、DC组(20.66%±2.71)、对照组( 19.09%±2.73 ),DC/MFC/4-1BBL组与其它治疗组和对照组比较有统计学差异,P 0.05。DC/MFC组与DC组和对照组比较有统计学差异(P 0.05),DC组与对照组之间差异无统计学差异(P 0.05)。 4.4各组小鼠全身免疫状态的观察 CD4~+T细胞含量:DC/MFC/4-1BBL组与其它治疗组和对照组比较有统计学差异,P 0.05。DC/MFC组与DC组和对照组比较有统计学差异(P 0.05),DC组与对照组之间差异无统计学意义(P 0.05);CD8+T细胞的含量:各治疗组与对照组无统计学差异,P 0.05。NK细胞的含量:DC/MFC/4-1BBL组与其它治疗组和对照组比较有统计学差异,P 0.05。DC/MFC组与DC组和对照组比较有统计学差异(P 0.05),DC组与对照组之间差异无统计学意义(P0.05)。结论: 1 4-1BBL基因应用脂质体法转染后,可以在小鼠胃癌MFC细胞内稳定表达。 2与其它各组相比,DC/MFC/4-1BBL瘤苗能明显延缓荷瘤小鼠胃癌细胞的生长,瘤体重量轻,抑瘤率高于其它治疗组。表现出更强的体内抑制肿瘤生长的活性 3 DC/MFC/4-1BBL治疗组的肿瘤细胞凋亡率高于其它各组,提示DC/MFC/4-1BBL瘤苗能够促进肿瘤细胞的凋亡。 4与其它各组相比,DC/MFC/4-1BBL疫苗治疗615荷瘤小鼠后外周血中CD4~+T细胞和NK细胞均处于一个较高的水平,提示此疫苗能够提高荷瘤宿主的免疫力。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392;R735.2

【参考文献】