神经肽Y对巨噬细胞肿瘤坏死因子α产生的影响及其机制

发布时间：2019-04-02 02:22

【摘要】： 神经肽Y(Neuropeptide Y NPY)是一种含有36个氨基酸的多肽,广泛分布于中枢和外周神经系统,参与摄食行为、心血管活动、精神活动和痛觉调制等生理功能的调节。除了上述功能以外,NPY还参与了哺乳动物免疫功能的调节,在一些自身免疫性疾病的发生发展中起到了关键的作用。NPY通过六种不同的G蛋白偶联受体亚型来发挥作用,包括Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6受体。研究表明,多种免疫细胞,包括T细胞、B细胞、单核巨噬细胞等能够表达NPY及其受体,并且在炎性刺激如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的刺激下,巨噬细胞能够分泌NPY。近年来的研究发现,与正常巨噬细胞相比,Y1受体敲除的巨噬细胞给予LPS刺激后,分泌肿瘤坏死因子(Tumer necrosis factorα,TNF-α)的水平下降。正常巨噬细胞应用Y1受体拮抗剂后给予LPS刺激后,TNF-α的分泌水平也出现下降。表明NPY可以通过Y1受体调节巨噬细胞TNF-α的产生。但其分子机制不清。本课题以小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞为实验模型,研究NPY对巨噬细胞在LPS刺激下产生促炎细胞因子TNF-α的影响,并且初步探讨其可能的机制。本实验通过半定量RT-PCR检测了RAW264.7细胞株的Y1受体的mRNA水平;酶联免疫吸附实验检测细胞培养上清中的TNF-α含量;Western blot检测NPY对RAW264.7细胞内相关信号分子的激活程度。研究工作取得的主要结果如下: 1.RAW264.7细胞的Y1受体的mRNA的表达:通过RT-PCR检测了RAW264.7细胞株的Y1受体的mRNA水平,发现RAW264.7细胞株有Y1受体mRNA表达。 2.NPY对RAW264.7细胞LPS引起的TNF-α产生的影响:10~(-8)M NPY和100ng/mlLPS共同处理RAW264.7细胞0.5h,4h后收集上清检测TNF-α,发现NPY能够显著提高LPS引起的TNF-α产生;预先加入Y1受体的抑制剂PD160170能够阻断NPY的效应,说明NPY能够通过Y1受体提高RAW264.7细胞在LPS刺激下TNF-α的产生。 3.NPY对RAW264.7细胞LPS引起的MAPKs激活的影响:10~(-8)M NPY和100ng/mlLPS共同处理RAW264.7细胞0-0.5h,裂解细胞,收集蛋白进行Western blot分析,发现NPY能够增强LPS引起的ERK的激活,而对JNK和p38的激活没有影响,说明NPY可能通过增强LPS引起的ERK的激活来提高TNF-α的产生。 4.NPY对RAW264.7细胞PI3K和PKC激活的影响:10(-8)M NPY处理RAW264.7细胞0-10min,发现NPY能够显著提高PI3K p85的磷酸化,不能激活PKC,Y1受体拮抗剂可以阻断此效应。推测NPY可能通过激活PI3K通路来增强ERK的激活和TNF-α的产生。 5.NPY激活的PI3K通路对RAW264.7细胞LPS引起的TNF-α和ERK激活的作用:预先应用1μM的PI3K通路阻滞剂wortmannin孵育细胞30min后,加入10~(-8)M NPY和100ng/ml LPS共同处理RAW264.7细胞0-30min,发现NPY增强LPS引起的ERK的激活的效应没有被阻断,NPY提高RAW264.7细胞在LPS刺激下TNF-α的产生的效应也不能被wortmannin阻断。NPY快速激活的PI3K信号通路并不参与其对ERK的激活和TNF-α产生的正向调节作用,NPY/Y1可能通过其他信号分子来调控LPS引起的ERK激活,进而调节TNF-α的产生。总之,NPY通过Y1受体对RAW264.7细胞LPS引起的TNF-α产生存在正向调节作用,该作用可能是通过增强LPS引起的ERK激活实现的。以往研究发现,在不同的细胞中NPY能够通过激活PKC或是PI3K通路来激活ERK信号通路。本课题研究发现,NPY能够快速激活PI3K通路,但NPY调节LPS引起的ERK的激活与NPY引起的PI3K通路的激活并不相关,说明有可能存在别的分子参与此过程。我们前期的实验发现10~(-8)M的NPY能够快速激发Y1受体介导的内吞作用。有研究表明Y1受体在NPY的刺激下存在网格蛋白介导型内吞作用,而且快速内吞过程中伴随着β-arrestin 2的结合。β-arrestin 2作为连接分子能够促进Raf依赖的ERK激活,在今后的工作中,我们将研究Y1受体介导内吞中的β-arrestin 2或是NPY/Y1下游的别的信号分子是否参与调节LPS引起的ERK激活过程。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363

【共引文献】