基于RG技术H5N1高致病性人用禽流感疫苗株的制备及初步评价

发布时间：2019-04-03 22:02

【摘要】： 当前，高致病性人禽流感病毒（H5N1）已在15个国家和地区发生，死亡率高，特别是印尼家族性感染被美国科学家证实为人传染人事例后，使得大流行流感防控形势异常严峻。WHO预言，下一次流感大流行不是有和无的问题，而是早和晚的问题。目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亚洲，特别是印尼、越南和中国，对其分离的毒株进行血清学、致病性和基因结构等分析表明，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度变异的特性，就中国分离的毒株而言就存在南北之分。因此，WHO要求各国加强技术储备，制备合格有效的人用疫苗。而疫苗研制的最关键因素是有效疫苗株的获得，尤其是针对本地区病毒流行特点，制备适合当地使用的大流行流感疫苗株。 1999年以后Neumann等、Hoffmann等建立了完全以质粒为基础的流感病毒反向遗传操作系统，显示了对相关研究的良好应用前景。本研究选择一个中国大陆分离株A/xinjiang/1/2006（H5N1），对其进行全基因组序列测定和遗传进化分析，然后将2个基因cDNA(HA、NA)克隆入Hoffmann等构建的双向转录/表达载体pHW2000，其中HA基因经过减毒修饰，与PR8（H1N1）的内部基因组合，用8质粒病毒拯救系统产生了H5N1亚型基因重组病毒，从而产生了致弱表型的H5N1重组病毒，并对拯救的病毒作为疫苗的特点进行初步分析。我们的研究共分为三个部分：A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因修饰及8质粒系统的构建、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG病毒株的拯救、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG作为疫苗株病毒的评价。第一、A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因修饰及8质粒系统的构建：在BSL-3培养代表中国第三进化体系的高致病性人禽流感病毒A/xinjiang/1/2006（H5N1）株，常规方法提取病毒总RNA，并反转录为cDNA。设计带有BsmBI、BsaI酶切位点的引物扩增A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA、NA两个基因全长片段，并在HA基因中共引入了基因突变，删除可以将HA裂解为HA1、HA2的四个碱性氨基酸，，以达到降低病毒毒力的作用。将HA、NA两个基因片段克隆入pHW2000，并进行了测序验证和错误位点的修正，与PR8作为骨架病毒的6个质粒组合为2+6的polⅠ-polⅡ系统的转录/表达质粒体系，以期通过同一个载体、转染后利用细胞中的polⅠ和polⅡRNA聚合酶、实现重组病毒vRNA和mRNA的转录和表达。第二、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG病毒株的拯救：将构建好的2质粒和PR8 6质粒共转染COS-1细胞，获得重组的H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒。病毒转染过程中对转染条件进行了反复摸索，以期建立稳定的转染体系，包括转染试剂的选择、细胞密度的选择、转染时间的探索等。经过反复研究获得了拯救人禽流感病毒稳定的转染条件。对于拯救的H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒，我们分别运用RT-PCR扩增病毒基因片段并测序来直接验证病毒的型别；血凝实验、间接免疫荧光实验检测可间接验证病毒拯救的成功；运用电镜来观察病毒的形态。实验结果表明，拯救H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG疫苗株病毒基因序列中HA、NA序列与A/xinjiang/1/2006（H5N1）相同，其中HA裂解位点的四个碱性氨基酸已经成功删除；病毒血凝滴度可达到1:320以上；免疫荧光检测可以发现病毒存在；电镜下病毒形态正常，成丝状和囊状，与普通流感病毒形态相似。反向遗传操作技术的建立，为进行禽流感病毒基因结构与功能、致病性和疫苗候选株的构建等方面的研究提供了新的手段。第三、H5N1/A/xinjiang/1/2006-RG 疫苗株病毒的评价：运用RG技术制备的重组病毒，最终目的是运用于人用疫苗的制备。因此，对疫苗株进行评价是本研究的关键环节，包括病毒株的稳定性、安全性、免疫原性检测。病毒稳定性评价采用鸡胚连续传12代，分别检测2、4、6、8、10、12代的病毒基因系列及EID50、血凝滴度，结果表明不同代次基因序列同源性达到99.8%，EID50为7左右，血凝滴度在1:320以上，病毒传代稳定，无基因突变和毒力恢复现象；病毒安全性检测采用CPE、病毒蚀斑实验、EID50、鸡静脉致病指数来检测重组病毒毒力，拯救的疫苗株病毒其细胞病变较野毒株明显减轻，且空斑直径在加入TPCK胰酶为1-2mm之间，EID50为7.5，IVIP为0，所有结果都表明，我们拯救的H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG病毒毒力明显降低，符合WHO对大流行流感疫苗（H5N1）株的规定和要求；病毒免疫原性检测采用动物免疫法，用纯化灭活H5N1/xinjiang /1/2006-RG疫苗株肌肉免疫Balb/c小鼠，通过血凝抑制来初步验证病毒的免疫原性，结果显示，血凝效价两次免疫后为1:40-1:640，两种实验方法的特异性抗体滴度具有相关性，说明拯救的病毒具有良好的免疫原性。以上研究表明，我们制备的H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG疫苗株可以用于疫苗生产。结论：成功的对流感病毒A/xinjiang/1/2006（H5N1）HA基因进行了定点突变，运用PR8为骨架病毒的拯救系统在COS-1细胞上进行高效拯救。同时，对拯救的病毒H5N1/A/xinjiang /1/2006-RG进行评价，表明拯救的疫苗株病毒具备良好的稳定性、安全性、免疫原性。并建立了大流行流感疫苗株拯救的技术体系，为应对流感大流行做好了技术贮备。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

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