蜱传脑炎病毒新疆株的分离鉴定及两种脑炎诊断抗原的评价

发布时间：2019-04-11 16:31

【摘要】：虫媒病毒（Arthropod-borne viruses, Arboviruses）是一大类通过吸血节肢动物叮咬易感脊椎动物而传播的病毒，能引起严重的人畜共患性疾病。随着全球气候转暖、疫源地变迁，未知、新发的虫媒病毒层出不穷。虫媒病毒的传播和流行给人类健康和经济生产的影响不断显现。快速、准确的检出、发现虫媒病毒对于临床诊断和监测流行状态都具有十分重要的意义。目前已知的虫媒病毒种类已达上百种，主要分布于黄病毒（Flaviviridae）、布尼亚病毒（Bunyaviridae）和披膜病毒（Togaviridae）三大群成员。虫媒病毒多样性高的特点是病毒检测的一大难题，经典的病毒分离培养方法繁琐，，耗时长、人力成本高，对操作人员经验和技术都有很高要求；血清学方法需要病毒特异性抗原或抗体。目前，病毒的核酸检测方法更为普及，常规的PCR与荧光定量PCR、核酸杂交以及在此基础上发展起来的基因芯片等，都依赖于病毒基因组序列的获得，对于检测新发甚至完全未知的病毒存在较大局限性。近年来发展起来的高通量测序（High-throughput sequencing）技术能够同时对待测样本中兆级数量的核酸分子进行测序，不依赖病毒的分离培养，尤其适合从混杂的临床或环境样本中发现重要的病原微生物，成为鉴定未知病原体的较为有效的技术手段。在蜱、蚊等媒介节肢动物体内，虫媒病毒感染宿主细胞后可被宿主RNA干扰机制识别，产生大量的病毒源性小干扰RNA(virus-derived small interfering RNA, vsRNA)，是宿主抵御病毒感染的重要机制。vsRNA本质上是经宿主细胞酶切加工的病毒基因组微小片段，通过拼接即可将其还原成为全长的病毒基因组序列。我国新疆地区生态景观多样，气候类型复杂，存在多处自然疫源地，媒介节肢动物种类繁多，分布广泛。本研究对取自新疆维吾尔自治区夏尔西里自然保护区的蜱标本进行vsRNA高通量测序，对蜱自然携带的虫媒病毒进行筛查，通过对高通量测序数据进行分析，快速、准确地了解自然疫源地主要存在的虫媒病毒种类，并进一步通过常规方法对高通量测序技术发现的虫媒病毒进行鉴定。基于病毒源性小RNA的高通量测序技术可为虫媒病毒的甄检和我国自然疫源地的本底调查提供一种新的途径。本研究首先对采集到的蜱进行总RNA和小RNA提取，将小RNA进行高通量测序，对所得到的高通量测序数据进行基础分析。高通量测序共得到蜱小RNA有效数据为17558502个读序，去除重复读序并采用比对到全病毒基因组和组装病毒这两种策略进行病毒分析，其中32631个读序比对到病毒基因组，丰度值最高的为蜱传脑炎病毒读序。将蜱虫的研磨液接入BHK-21细胞培养，盲传3代后细胞出现圆缩、脱落等典型的细胞病变现象，分离毒株获取病毒核酸后用黄病毒属通用引物、TBEV特异引物对该病毒株进行RT-PCR，结果显示核酸为阳性，上述结果初步证实我们分离得到的病毒是一株蜱传脑炎病毒。我们利用分段扩增的方法获得病毒的全基因组序列，全长为11103nt，其中5’末端非编码区长为131nt，3’末端非编码区长为727nt，将其命名为TBEV-XinJiang01，全序列信息公布于Genbank，登录号为JX534167。首先对该毒株基因组编码区构建进化树进行序列分析，结果发现它属于TBEV远东亚型，与俄罗斯境内的两株毒株较为接近，与我国东北分离株之间还存在着一定的差异，编码区序列中存在一些可能具有生物学意义的氨基酸变异位点；然后对3’非编码区构建进化树进行序列分析，发现它与欧洲亚型和西伯利亚亚型更为接近，而与我国东北株为代表的远东亚型之间差异较大，具体序列差异表现为蜱传脑炎新疆株有着更长的3’非编码区序列。进一步对新疆地区分离得到的蜱传脑炎新疆株和我国东北地区发现的蜱传脑炎病毒牡丹江株进行了相关复制特性的比较，初步证实在相同条件下，蜱传脑炎病毒新疆株的增殖能力要弱于我国东北地区的蜱传脑炎病毒牡丹江株。本研究是首次报道并从我国新疆地区分离到蜱传脑炎病毒。另外，本研究对蜱传脑炎病毒和乙型脑炎病毒的两个候选诊断抗原应用临床阳性血清进行了评价。首先针对蜱传脑炎病毒的EDⅢ区域和乙型脑炎病毒的EDⅢ区域设计特异性的PCR扩增引物，通过RT-PCR扩增两种病毒的RNA获得目标产物，并分别构建重组表达质粒，在E.coli BL21中表达，获得目的抗原并进行纯化。将纯化得到的蜱传脑炎病毒EDⅢ抗原和乙型脑炎病毒EDⅢ抗原进行系列稀释后同时点制在ELISA微孔板中，采用Array-ELISA技术同时检测这些临床病人血清及正常人血清，其中针对55份临床TBE病人血清样本检测到36份TBEV感染阳性，检出率为65.5%；针对8份临床JE病人血清样本检测到5份JEV感染阳性，检出率为62.5%；正常人血清检测结果全部为阴性。实验所使用的临床蜱传脑炎病人感染血清样本和临床乙型脑炎病人感染血清均曾采用全病毒免疫荧光法检测到血清中的特异性抗体，结果表明这两种抗原用于临床患者的诊断具有较好的检测特异性，有着较高的检出率，但同时会存在一定程度的漏检。本研究使用高通量测序技术鉴定蜱体内携带的病毒，通过高通量测序建立小RNA库，并将所获得的病毒reads采用比对到病毒基因组和组装的策略，分析得到了媒介生物体内携带的部分虫媒病毒，通过一系列常规的病毒检测方法对高通量检测分析结果进行了验证。同时我们对蜱传脑炎病毒EDⅢ区域和乙型脑炎病毒EDⅢ区域的诊断价值进行了评价，为临床血清学诊断技术的发展及血清学检测试剂的研制提供了理论指导。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.3

【参考文献】