群勃龙的化学修饰及其免疫原性的构建

发布时间：2019-04-13 17:40

【摘要】： 群勃龙化学名为去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate),是人工合成的甾类男性激素,也是家畜的生长促进剂,人服用这类肉制品同样会给身体健康带来危害。此外,群勃龙也成为体育比赛兴奋剂的一个可能来源。欧盟禁止进口使用该类产品的食品,也是我国海关禁止检出的31种兽药之一。目前,群勃龙在食品中残留量的检测主要依赖于质谱技术,如气相色谱-质谱技术(GC-MS)、液相色谱-质谱技术(LC-MS)等。随着单克隆抗体技术、分子生物学及现代免疫测定技术的发展,建立方便于基层检验检疫部门应用的快速、灵敏的群勃龙检测方法,对从源头上监测、控制此类物质的扩散具有重要意义。群勃龙是小分子化合物,需要与大分子载体(蛋白质)偶联后才具有免疫原性。本研究采用琥珀酸酐对群勃龙进行化学修饰,并将获得的群勃龙-半琥珀酸酯(TR-HS)与BSA偶联以赋予其免疫原性,经注射家兔分析免疫效果和建立ELISA监测方法。目的：群勃龙(Trenbolone, TR)化学名为去甲雄三烯醇酮(17-β-hydroxyestra-4,9,11-trien-3-one-17-acetate),TR是一小分子半抗原物质,为了赋予其免疫原性,对其化学结构作适当修饰并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,以期获得群勃龙完全抗原,继而制备群勃龙特异性抗体和建立群勃龙特异性检测方法。方法： (1)利用红外光谱、质谱分析、核磁共振对所购群勃龙原料结构进行鉴定。 (2)结构的修饰：将群勃龙和琥珀酸酐,以吡啶溶解,80°C搅拌反应3h。反应液冷却至室温,调整其pH为3.0,得棕黄色粘稠物,过夜后变硬。用热的异丙醇重结晶提纯,红外灯烘干即为TR-半琥珀酸酯(TR-HS),采用质谱法对其分子量进行预测,利用红外光谱核磁共振对其鉴定。 (3) TR-HS与BSA偶联物的制备：采用混合酸酐法和碳化二亚胺法(EDC),将TR-HS与BSA偶联制备成偶联物。混合酸酐法：TR-HS与BSA按摩尔比100：1反应：取TR-HS 5.5 mg溶于2mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,置4℃冰箱中预冷10 min,于冰浴磁力搅拌,加入三丁胺30μL,再加入氯甲酸异丁酯151μL,然后将该溶液置4℃冰箱中反应1h即为反应液Ⅰ液；取10.0mg BSA溶于2mL蒸馏水,溶解后于冰浴边搅拌边用1 mol/L NaOH调pH为8.5制得Ⅱ液；边搅拌边将Ⅰ液缓慢滴加到Ⅱ液中,于4℃搅拌反应过夜。反应产物充分透析,即得TR-BSA偶联物溶液,将其冷冻干燥保存备用。碳二亚胺法(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,EDC)法：TR-HS与BSA按摩尔比100：1反应。取TR-HS. NHS, EDC按摩尔比1：1：l溶于1ml DMF,混匀后于4℃下活化1h,此为反应液Ⅰ液；取10mg BSA溶于3mL双蒸水中,加DMF0.5～1.0ml混匀,4℃预冷20min,得Ⅱ液；边搅拌边将Ⅰ液缓慢滴加到Ⅱ液中,于4℃搅拌反应过夜。反应产物充分透析,即得TR-BSA偶联物,冷冻干燥保存。 (4)包被抗原：OVA与TR-HS偶联所得,方法同BSA与TR-HS偶联中的混合酸酐法。 (5)采用MALDI-TOF.紫外光谱法分析偶联结果。 (6) TR-BSA免疫家兔制备抗血清将制备的TR-BSA用完全福氏佐剂常规法免疫家兔,用TR-BSA与不完全福氏佐剂乳化后加强免疫。获得的免疫血清用ELISA间接法和双向免疫扩散,测定特异性抗血清效价,分析其免疫原性和判断免疫效果。结果： (1)本研究所采用TR原料经鉴定红外特征峰与理论相符,核磁共振氢谱、碳谱各根值与理论一致。 (2)群勃龙化学修饰物鉴定 KBr压片红外测试,2974 cm-1为羧基上的O-H不对称伸缩振动峰,1738 cm-1为骨架六元环上C=O不对称伸缩振动峰。气相质谱显示的基峰,MS(EI):m/z= 270,此峰为化合峰碎裂形成的最强峰。'H NMR (400 MHz, CDC13, rt):δ= 0.96 (s,3H, CH_3),1.32 (m,1H, CH2), 1.54 (m,3H, CH_2),1.61 (m,1H,CH_1),1.93 (d,1H, J= 12.4, CH2),2.27 (m,1H,CH_1),2.44-2.60(m,5H, CH2),2.69-2.72 (m,4H, CH2),2.86 (m, 2H, CH2),4.84 (t,1H, J= 7.6,OCH),5.81 (s,1H, CH),6.36 (d,1H, J= 9.6, CH),6.44 (d,1H, J= 10.0, CH),经过1H NMR、13CNMR、NMR二维图、IR、MS确认其结构。 (3)用PRF-S02(ultraflexTOF/TOF)仪器检测BSA、混合酸酐法制备的TR-BSA,两者的相对分子量分别为Mr.6,7146和Mr.7,4471。由此估算偶联比率为20.8。 (4)紫外／可见分光光度计对BSA、TR-HS、TR-BSA进行扫描测定显示,混合酸酐法、EDC法所得偶联物峰形发生明显变化,278nm吸收峰明显降低,且在343nm处吸收值明显增大,说明偶联是成功的。以20%乙醇为溶剂并以之调零,紫外光度法估算偶联比率,混合酸酐法结合比约为1：18；EDC法结合比约为l：12。 (5) TR-BSA免疫的家兔血清,经ELISA测得TR特异性抗体效价为1：320000；双向免疫扩散测得的抗血清效价为1：16。结论： (1)成功合成了TR-半琥珀酸酯(TR-HS)。 (2)成功制备了具有明显免疫原性的TR-BSA偶联物,为群勃龙单克隆抗体的制备和建立食品中群勃龙残留量的快速检测方法奠定了基础。 (3) TR-BSA经免疫家兔获得了较高效价的抗血清,表明此偶联物具有良好的免疫原性,为开展针对TR半抗原的免疫检测和TR污染监测奠定了基础。
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【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392.11

【引证文献】