结核分枝杆菌基因分型及异烟肼新耐药突变位点的确认研究

发布时间：2019-04-14 20:26

【摘要】： 目的为了有效控制和预防结核病的流行和传播,除了全面实施结核病控制专项外,我们还需要建立健全流行病学监测体系,加强对结核分枝杆菌耐药机制和耐药结核病监测的研究。为此,我们对近几年福州地区分离的结核分枝杆菌临床分离株进行分子流行病学研究,以期了解本地区流行菌株的主要基因型及其分布情况,并评价基因分型的效果;从体内和体外两个层面对突变位点与耐药的关系进行研究,以阐明katG基因新的突变引起异烟肼耐药的机制;利用反向分子杂交方法检测基因突变位点,为建立耐药基因快速检测方法奠定基础。方法 1.运用Spoligotyping方法对福州地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并与国际数据库SpolDB4进行比较;同时对本地区北京基因型与非北京基因型在年龄、性别、耐药株的分布情况进行比较分析; 2.运用MLVA-15方法对上述分离株进行基因分型,通过生物信息学软件(Bionumerics5.0)对各基因型进行聚类分析,比较不同组别患者结核分枝杆菌成簇率的差别,探讨结核分枝杆菌易于传播的人群特征; 3.用HGDI指数比较两种基因分型方法的效率; 4.选取菌株FJ05122(含新突变位点Asn329Val)、FJ05005(含常见突变位点Ser315Thr)和H37Rv(含野生型katG基因)分别作为实验株、对照株和标准株,构建单独含上述突变位点和Arg463Leu位点、上述位点与Arg463Leu联合突变位点、野生型katG基因的重组表达克隆和重组穿梭载体克隆; 5.以pProEx HTb质粒构建的各重组克隆表达重组KatG蛋白,纯化后进行酶活性双重染色以及过氧化氢酶、过氧化物酶活性测定,比较不同重组KatG蛋白酶活性的差异; 6.以pMV361质粒构建的各重组穿梭载体克隆电转化耻垢分枝杆菌INH低耐药株和高耐药株,比较基因导入前后转化菌INH最小抑菌浓度MIC的改变; 7.对福州地区结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因热点突变区进行测序,了解福州地区耐药基因突变的特点; 8.设计反向分子杂交探针,用于检测耐药菌株的基因突变位点,并与测序结果相比较,评价该检测方法的敏感性和特异性。结果 1. 245株菌中,有223株为已知的spoligotype,22株(21种)为SpolDB4未曾记录的新基因型;福州地区流行的结核分枝杆菌基因型主要为北京基因家族、H3基因家族、T1基因家族,分别占53.06%(130/245)、14.69%(36/245)、9.80%(24/245)。 2. Spoligotyping分型将245株结核分枝杆菌分为70种基因型,其中成簇基因型16个,独特基因型54个,分辨率76.78%,菌株成簇率77.96%;最大一簇菌为北京基因型,北京基因型与非北京基因型在年龄、性别、耐药株的分布均没有显著性差异。 3. MLVA分型将245株结核分枝杆菌分为163种基因型,其中成簇基因型27个,独特基因型136个,分辨率98.28%,菌株成簇率44.49%;MLVA各位点多态性在0.040~0.661之间,其中ETR-E、MIRU26、MIRU10位点的多态性较好(h0.58), MIRU23位点的多态性较差(h0.10)。 4.两种方法联合使用时,116株北京基因型菌通过MLVA可以进一步分成65个基因型(14簇和51个独特基因型),成簇基因型减少为24个,独特基因型增加为182个,分辨率至98.65%,菌株成簇率35.51%。 5.与重组野生型KatG比较,Asn329Val突变可引起含该突变位点的重组KatG过氧化氢酶活性丧失,过氧化物酶活性降低约30%;Ser315Thr突变导致重组KatG过氧化氢酶活性下降约60%,过氧化物酶活性降低约30%。 6.含Asn329Val、Ser315Thr突变的katG基因进入耻垢分枝杆菌后,转化菌的MIC较母本株增高,增加INH耐药性;而野生型katG基因则使转化菌的MIC较母本株降低,增加对INH敏感性。这种效果在INH低耐药株和高耐药株表现一致。 7.福州地区耐药菌株中,rpoB基因突变主要发生在Ser531、His526、Asp516,发生率分别为51.72%、17.24%、8.05%;katG基因突变类型主要为Ser315Thr,发生率为46.91%。 8.利用反向杂交方法检测结核分枝杆菌耐药突变位点,在97株分离株(包含79株耐多药菌株和18株全敏感株)检测中,与测序结果比较, rpoB基因突变检测的敏感性、特异性和一致性分别为87.69%、96.88%、90.22%;katGS315T突变检测的敏感性、特异性和一致性分别为94.44%、90.16%、91.75%。结论 1.北京基因型是福州地区结核分枝杆菌主要的流行基因型,占53.06%;北京基因型与非北京基因型在年龄、性别、耐药株分布情况均没有显著性差异;检测出21种SpolDB4未有记录的新的Spoligotypes; 2. Spoligotyping和MLVA是简便可行的基因分型方法,可以用于流行病学监测。Spoligotyping的效率低于MLVA,但Spoligotyping方法易于鉴别北京基因型;两种方法联合应用,可以提高基因分型的分辨率。 3. MLVA位点多态性差别较大,可以剔除多态性低的位点,增加多态性高的位点,以提高MLVA的分辨率。 4. katG基因Asn329Val突变,其重组蛋白过氧化氢酶活性丧失,是导致菌株耐药的机制;该突变基因转化进入耻垢分枝后,转化菌MIC较母本株增加,进一步说明了该位点直接导致了菌株对异烟肼的耐药性; 5.反向分子杂交方法可以快速、简便地检测耐多药菌株的热点耐药突变。
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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378.911

【参考文献】