CD82在人早孕期母—胎界面的调节作用

发布时间：2019-04-20 07:49

【摘要】： 母-胎界面滋养细胞具有独特的类似于肿瘤细胞的生物学行为,即高增殖和侵袭能力。滋养细胞增殖与侵袭对于囊胚植入、胎盘发育,并建立恰当的母-胎关系至关重要。滋养细胞增殖与侵袭功能障碍是子痫前期、胎儿宫内生长受限(FGR)、自然流产等妊娠相关疾病的主要原因。但在正常妊娠,滋养细胞很少发生无限制增殖和远处转移,提示可能受到细胞间直接或间接的分子调控,使其促侵袭和抑制侵袭维持生理性动态平衡。母-胎界面微环境细胞与分子间的相互作用可以调节滋养细胞侵入子宫内膜及蜕膜。因此,母-胎界面参与调控滋养细胞侵袭力的关联分子,可以影响胚泡的正常植入和生长。 CD82蛋白是一种广泛表达的Tetraspanin超家族跨膜糖蛋白,是经典的肿瘤细胞侵袭抑制基因。已有研究证实CD82是细胞迁移的一个重要调节蛋白,CD82低表达与肿瘤细胞的侵袭和转移相关,致使多种晚期恶性肿瘤的不良预后。因此我们推测CD82可能参与母-胎界面滋养细胞侵袭能力的调控；解析CD82在母-胎界面的作用机制,及解析调控CD82表达的相关蛋白和基因将有助于阐明生理状态下胚泡植入和病理性滋养细胞疾病的发病机制,对治疗滋养细胞疾病亦具有潜在的临床应用价值。本研究在前期工作基础上,进一步关注CD82作用于人早孕期滋养细胞的分子机制,拟阐明CD82对滋养细胞功能调控的分子机制；CD82表达调控,及其在母-胎界面促进滋养细胞和蜕膜基质细胞交叉对话,调节滋养细胞侵袭能力的分子机制。目的分析CD82在正常和早期妊娠失败母-胎界面的表达及其表达调控。方法收集人早孕期正常或不明原因自然流产的绒毛与蜕膜组织,应用本实验室建立的胰酶消化、密度梯度离心法分离、培养正常人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞(DSCs)。采用RT-PCR、定量real-time RT-PCR、免疫组织化学、免疫细胞化学和传统免疫印迹杂交法,分别检测母-胎界面CD82的表达,比较分析CD82在正常早孕与早期妊娠失败母-胎界面的表达差异。对原代培养的蜕膜基质细胞进行多种干预,包括妊娠相关激素和炎性介质,用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。结果原代蜕膜基质细胞转录、翻译CD82；而原代滋养细胞不转录和翻译CD82。从mRNA和蛋白水平分析蜕膜组织中CD82的表达水平,发现正常早孕期蜕膜明显低于早期妊娠失败的蜕膜。生理浓度范围hCG能下调蜕膜基质细胞表达CD82(以10kU/L浓度作用最佳)；单独生理浓度孕激素和17β雌二醇对蜕膜基质细胞表达CD82无明显调节作用；但孕激素可以协同hCG进一步下调蜕膜基质细胞表达CD82。LPS促进蜕膜基质细胞表达CD82; IL-1β中和性抗体能拮抗LPS对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用。结论CD82在人早孕期母-胎界面蜕膜基质细胞表达,明显低于早期妊娠失败蜕膜,提示母-胎界面CD82异常表达可导致妊娠失败。hCG下调蜕膜基质细胞表达CD82,提示CD82与正常妊娠有关,并可能参与控制滋养细胞疾病的发生、发展；LPS通过刺激炎性介质IL-1β的分泌,上调CD82的表达,提示CD82可介导炎症导致的自然流产。目的解析CD82在人早孕期母-胎界面的生物学功能。方法原代培养人早孕期蜕膜基质细胞和滋养细胞,利用siRNA干扰技术,成功沉默蜕膜基质细胞CD82的表达,并建立直接或间接共培养体系；利用质粒pCNA3.1(+)-CD82转染滋养细胞肿瘤细胞系BeWo,成功实现BeWo细胞过表达CD82。蜕膜基质细胞经沉默CD82后,与原代滋养细胞共培养,此后采用Matrigel侵袭试验分析滋养细胞的侵袭力。分析BeWo细胞经转染CD82后的侵袭力；分别用定量real-time RT-PCR、in-cell Western和免疫荧光法分析蜕膜基质细胞沉默CD82后,及BeWo细胞过表达CD82后,侵袭相关分子的mRNA和蛋白表达水平。结果蜕膜基质细胞经CD82沉默后,与原代滋养细胞共培养,使滋养细胞侵袭力明显增强；蜕膜基质细胞表达TIMP1明显下调,integrinβ1和integrinavP3表达明显上调；而MMP2、MMP9、TIMP2和titin表达无明显改变。相反,转染CD82的BeWo细胞侵袭力明显减弱,TIMP1表达明显上调,integrinβ1和integrinαvβ3表达明显下调；同样,MMP2、MMP9、TIMP2和titin表达无明显差异。结论蜕膜基质细胞表达CD82或滋养细胞过表达CD82均可控制滋养细胞的侵袭力,通过升调节TIMP1表达,实现滋养细胞与蜕膜基质细胞的交叉对话。目的探讨CD82调节人滋养细胞侵袭性的信号通路。方法应用siRNA转染蜕膜基质细胞沉默CD82的表达；质粒转染BeWo细胞过表达CD82,然后分析沉默及过表达CD82对侵袭相关的关键信号通路分子表达的调控作用。为了分析CD82抑制滋养细胞侵袭能性的信号通路,建立蜕膜基质细胞和原代滋养细胞共培养体系,及BeWo细胞单独培养体系,分别加入integrinβ1中和性抗体或MAPK/ERK信号通路阻断剂U0126,用Matrigel侵袭试验分析各组滋养细胞的侵袭力,以解析integrinβ1和MAPK/ERK1/2信号通路在CD82调节人早孕期滋养细胞侵袭中的作用；继而用in-cell Western分析各组TIMP1蛋白表达水平。结果在蜕膜基质细胞与原代滋养细胞共培养系统中,蜕膜基质细胞经沉默CD82后,使滋养细胞侵袭力明显增加,pERK1/2与总ERK1/2的比值明显升高,integrinβ1表达明显增加,TIMP1表达明显下降；而integrinβ1中和性抗体和U0126则明显降低滋养细胞的侵袭力,能逆转CD82沉默对滋养细胞侵袭力的增强作用,解除对磷酸化ERK1/2的升调节作用,提示蜕膜基质细胞表达CD82通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路,控制人早孕期滋养细胞侵袭。integrinβ1中和性抗体和U0126处理也能有效逆转CD82对TIMP1表达的升调作用。同样,转染CD82的BeWo细胞经integrinβ1中和性抗体和U0126处理也呈现类似效果。TIMP1的表达水平与滋养细胞细胞的侵袭力呈直线负相关。结论因此,CD82主要通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路,促进人早孕期蜕膜基质细胞表达TIMP1,上调的TIMP1依次抑制滋养细胞的侵袭能力。目的分析人早孕期母-胎界面SDF-1/CXCR4对CD82表达调节作用。方法收集人早孕期正常蜕膜和绒毛组织,对原代蜕膜基质细胞进行多种干预,包括原代滋养细胞培养上清、重组人SDF-1、重组人CCL2、抗人SDF-1、CXCR4、CCL2中和性抗体或CCR2拮抗剂。用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。同时建立蜕膜基质细胞和原代滋养细胞共培养体系,同时引入抗人CXCR4中和性抗体,Matrigel侵袭试验分析共培养体系滋养细胞的侵袭力。结果滋养细胞培养上清促进蜕膜基质细胞表达CD82；重组人SDF-1亦促进蜕膜基质细胞表达CD82; SDF-1或CXCR4中和性抗体可抑制滋养细胞上清对蜕膜基质细胞表达CD82的升调节作用。CXCR4中和性抗体直接处理滋养细胞明显降低其侵袭力；但CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞后,共培养体系中滋养细胞的侵袭力明显增加；CXCR4中和性抗体分别预处理滋养细胞和蜕膜基质细胞后,共培养体系的滋养细胞侵袭力降低。此外,CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞可以解除CD82对滋养细胞侵袭力的抑制作用。结论人早孕期母-胎界面滋养细胞分泌SDF-1,通过白分泌方式促进自身侵袭；通过旁分泌升调节蜕膜基质细胞表达CD82,控制滋养细胞的过度侵袭,使其侵袭力维持在正常适度范围,借此介导母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞的交叉对话。目的分析CsA调控母-胎界面CD82表达和滋养细胞侵袭力的分子机制。方法收集人早孕期正常蜕膜和绒毛组织,用CsA处理原代蜕膜基质细胞,或滋养细胞经CsA预处理后收获培养上清；用抗人SDF-1或CXCR4中和性抗体处理蜕膜基质细胞,然后用in-cell Western检测蜕膜基质细胞CD82的表达。于滋养细胞和蜕膜基质细胞的单独和共培养体系加入CsA, ELISA法分析培养上清中SDF-1的分泌；用抗人CXCR4中和性抗体分别预处理蜕膜基质细胞和/或滋养细胞后,然后进行共培养,在加入CsA后,Matrigel侵袭试验分析共培养体系滋养细胞的侵袭力。结果CsA对蜕膜基质细胞表达CD82无直接调节作用；但CsA能加强滋养细胞上清对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用；低浓度CsA能促进滋养细胞和共培养体系SDF-1的分泌；抗人SDF-1或CXCR4中和性抗体能抑制CsA通过滋养细胞对蜕膜基质细胞表达CD82的间接促进作用。在加入CsA的共培养体系中,抗人CXCR4中和性抗体预处理蜕膜基质细胞可以部分逆转CD82对滋养细胞侵袭力的抑制作用。结论CsA促进滋养细胞分泌SDF-1,放大人早孕期母-胎界面滋养细胞对蜕膜基质细胞表达CD82的促进作用；CD82进而抑制滋养细胞侵袭能力。因此,CsA可协调母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞之间的交叉对话。综上所述,本研究发现CD82对人早孕期母-胎界面具有多重调节作用：(1)通过抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信号通路促进TIMP1表达,抑制滋养细胞侵袭；(2)蜕膜基质细胞通过表达CD82,控制滋养细胞过度侵袭；(3)蜕膜基质细胞CD82过表达可导致早期妊娠失败；(4)滋养细胞通过分泌SDF-1促进蜕膜基质细胞表达CD82,促进人早孕期母-胎界面滋养细胞和蜕膜基质细胞之间的交叉对话,适度控制滋养细胞侵袭能力；(5)CsA通过促进滋养细胞分泌SDF-1,升调节蜕膜基质细胞表达CD82,参与滋养细胞侵袭能力的精密调控。此外,人早孕期母胎界面CD82的表达还受妊娠相关激素的调控。本研究为完善滋养细胞侵袭调控机制,及临床治疗反复自然流产等相关妊娠疾病提供了新策略与新思路。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R321

【参考文献】