阿仑膦酸钠对骨髓间充质干细胞骨向诱导作用初步研究

发布时间：2019-05-10 13:04

【摘要】： 目的：通过研究不同浓度的阿仑膦酸钠(Alendronate, ALN)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)增殖和成骨诱导分化能力的影响,评价不同浓度阿仑膦酸钠诱导液对hBMSCs成骨诱导分化的效率,从而初步确定阿仑膦酸钠诱导hBMSCs成骨分化的合适浓度。为阿仑膦酸钠联合BMSCs的临床应用提供实验依据,为防治骨质疏松(Osteoporosis, OP)提供一种新的思路。方法： 1.运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs； 2.倒置相差显微镜逐日观察原代及传代细胞的生长、增殖及形态特征,绘制生长曲线； 3.取生长状态良好的第四代细胞,通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物等鉴定hBMSCs； 4.诱导hBMSCs分化为成脂肪细胞,鉴定本实验所分离的hBMSCs具有多向分化能力； 5.取生长状态良好的第四代细胞,分为实验组(不同浓度的阿仑膦酸钠,A-F组)、空白对照组(L-DMEM,G组)和阳性对照组(地塞米松,H组)各自诱导成骨分化。 6.放射免疫法检测各组hBMSCs骨钙素的分泌能力 7.实时荧光定量PCR检测各组细胞培养液中Runx2和Osx mRNA的表达情况,并检测经成脂肪细胞诱导分化后细胞内脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)mRNA的表达情况。 8.统计方法对比分析得出结论。结果： 1.第四代细胞CD29和CD44阳性表达率分别为100%和99.8%,CD31和CD45阳性表达率分别为0.8%和0.4%。流式细胞仪检测证明本研究分离培养hBMSCs的方法可以获得高纯度的间充质干细胞。 2.hBMSCs体外诱导向脂肪细胞分化16d后,镜下可见胞浆内充满圆形脂滴,油红O染色阳性,经qRT-PCR检测有83.6±4.7%表达LPL,证实本实验分离的hBMSCs具有多向分化能力。 3.hBMSCs诱导分化至第7天时,A-F组大部分细胞仍呈长梭形,G组部分细胞开始出现形态学改变；A-F组细胞培养基中骨钙素表达较低(0.03ng／ml～0.08ng／ml),而H组为0.14±0.06ng／m1；在A-F组分别有1.3%～2.5%和1.1～2.6%细胞表达Osx和Runx2 mRNA,在地塞米松诱导组约28.6±4.3%和29.2±5.1%细胞表达Osx和Runx2 mRNA。 4.hBMSCs诱导分化至第14天时,A-F组部分细胞发生形态改变,在A-D组为8%～12%,在E组和F组最明显(20.7±1.4%和23.6±1.3%),G组为53.6±8.2%；A-F组细胞培养基中骨钙素表达较第7天增加,E和F组增加最明显(分别为0.27±0.09ng／ml和0.28±0.08ng／ml),与A-D组相比,差别具有统计学意义(P0.05),H组为0.46±0.13ng／ml；与第7天时比较,Osx和Runx2 mRNA表达在A-F组均有明显提高,尤其以E和F组明显(OsxmRNA：22.1±5.6%和25.6±5.3%,Runx2 mRNA：25.2±5.3%和27.8±5.8%),在地塞米松组Osx mRNA为55.8±10.2%,Runx2 mRNA为53.2±9.8%。 5.hBMSCs诱导分化至第21d时,A-F组细胞诱导分化率均较第7d和14d进一步提高,在地塞米松诱导分化组约84.2±10.6%细胞呈圆形。细胞诱导分化至第21d时,A-F组细胞培养基中骨钙素含量进一步增加,骨钙素含量增加趋势与细胞成骨诱导分化率增加趋势相似。hBMSCs经诱导分化21d时,A-F组细胞Osx和Runx2 mRNA表达量进一步增加,E组和F组超过50%细胞阳性表达,高于其他阿伦磷酸钠工作液诱导组；而在地塞米松诱导组,分别有87.5±11.5%和85.9±10.2%细胞表达Osx和Runx2 mRNA。 6.在阴性对照组,始终未见有细胞形态学改变、骨钙素表达和Osx和Runx2 mRNA表达。结论： 1.采用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的hBMSCs,并具有多向分化能力； 2.ALN能促进hBMSCs增殖和骨向分化,1×10-6mol／L为其诱导分化的合适浓度。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】