结核分枝杆菌诱导的THP-1细胞转化及其相关信号传导通路的研究

发布时间：2019-05-10 18:44

【摘要】： 背景和目的结核分枝杆菌(M.tuberculosis,Mtb)是已经发现的最为重要的传染性病原体之一。结核病在全球范围内的死灰复燃及多种耐药菌株的流行是控制结核病的重要策略之一。业已肯定,结核结节是结核病最基本、最重要的病理特征。早期结核结节主要由纤维母细胞分裂、增殖形成的肉芽组成,随着炎症反应的进展,逐渐被巨噬细胞转化而来的类上皮细胞(EC)、EC融合或核分裂形成的郎罕氏细胞所替代。有文献报道,Mtb感染宿主细胞后可引起MAPK、PI3K/Akt和JAK/STAT通路的激活或抑制,并且已有研究证实PI3K/Akt和MAPK通路介导细胞转化相关的信号传导。但上述通路是否参与结核杆菌感染时的单核/巨噬细胞向EC转化过程,至今未有报道。在以往工作基础上,本研究选用人结核分枝杆菌H37Rv株、牛分枝杆菌bovis株和草分枝杆菌phlei株3种菌株分别感染人单核细胞株THP-1,建立分枝杆菌感染细胞模型,用Pathscan(?)Phospho-p38 MAP kinase alpha(Thr180/Tyr182)Sandwich ELISA Kit、Pathscan(?)Phospho-Akt1(Ser473)Sandwich ELISA Kit和Pathscan(?)Phospho-Stat3(Tyr705)Sandwich ELISA Kit检测感染后胞内p38、Akt1和STAT3的磷酸化水平;采用间接免疫荧光技术检测分枝杆菌感染前后单核/巨噬细胞表面CD的表达情况,并用各通路特异性阻断剂进行验证;采用磷酸苯二钠比色法检测感染后胞内酸性磷酸酶活性的变化。方法人结核分枝杆菌H37Rv株、牛分枝杆菌bovis株和草分枝杆菌phlei株分别感染THP-1 2h,对照LATEX BEADS作用30min,终止感染后,分别于0h、0.5h、3h、6h和12h 5个时间点检测感染细胞中MAPK通路关键分子p38MAPK、PI3K/Akrt通路关键分子Akt1和JAK/STAT通路关键分子STAT3的磷酸化水平,以OD_(450)值的变化来表示。分别用上述通路特异性阻断剂SB203580、LY294002和AG490,预处理THP-1 30min后,分别加入3种菌株,37℃孵育72 h。分别加入抗CD分子的相应一抗及二抗,采用间接免疫荧光技术检测感染前后CD表达情况以及各通路阻断剂处理前后CD变化情况。人结核分枝杆菌H37Rv株、牛分枝杆菌bovis株和草分枝杆菌phlei株分别感染THP-12h,对照LATEX BEADS作用30min,终止感染后,分别于0h、24h、48h、和72h 4个时间点检测感染细胞中酸性磷酸酶活性的变化,以酶活性单位表示。结果H37Rv株或bovis株感染的THP-1细胞可出现一过性p38MAPK磷酸化水平上调,但PI3K/Akt和STAT3磷酸化水平均无明显变化。三株分枝杆菌感染的THP-1细胞均出现CD14、CD115表达减弱和CD82、CD138明显表达的现象。p38MAPK、PI3K/Akt或JAK/STAT通路被阻断后,上述三株分枝杆菌感染的THP-1细胞仍表达CD14、CD115。JAK/STAT通路被阻断时,各分枝杆菌感染的THP-1细胞仍表达CD82、CD138。但p38MAPK、PI3K/Akt通路被阻断时,H37Rv株和bovis株感染的THP-1细胞CD82、CD138表达消失。 THP-1细胞感染H37Rv株48h后,酸性磷酸酶水平有明显下降趋势。结论结核分枝杆菌H37Rv株和分枝杆菌bovis株感染后可诱导THP-1细胞向EC转化,p38MAPK、PI3K/Akt参与和调控了该转化过程,其中以p38MAPK通路较为重要。人结核分枝杆菌H37Rv株感染人单核细胞THP-1后,酸性磷酸酶活性变化明显,表明单核巨噬细胞功能发生变化,亦提示细胞转化。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R378

【参考文献】