基因修饰的NK-92细胞对erbB2阳性乳腺癌细胞的特异性杀伤

发布时间：2019-05-11 12:42

【摘要】： 目的：1.合成嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ的基因,并建立其真核表达载体；2.用嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ基因修饰NK-92细胞；3.建立荷人乳腺癌细胞MDA-MB453(erbB2阳性)、MDA-MB231(erbB2阴性)裸鼠皮下移植瘤模型；4.通过体外及体内实验研究基因修饰的NK-92细胞对erbB2阳性乳腺癌细胞的特异性杀伤。 方法：1.设计嵌合抗原受体的基因序列,由抗erbB2抗体单链可变区(scFv)、c-myc tag、CD8a(ENST00000283635)、CD28(ENST00000374478)及CD3ξ链(ENST00000392122)连接而成,化学合成长度为50-70bp的单链oligo,利用PCR将合成的oligo拼接成完整的序列,将完整的序列经HindⅢ和EcoRI酶切后连接至目的载体PCDNA3.1(+)中。2.用Amaxa Nucleofector技术将嵌合受体anti-erbB2scFv-CD28-ξ基因转入NK-92细胞。3.RT-PCR法检测抗原受体mRNA表达；免疫荧光法检测抗原受体在NK-92细胞表面的表达。4.流式细胞仪检测NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ和NK-92细胞表面CD27、CD158d、NKG2D和CD85j的表达变化。5.用CCK8法检测基因修饰的NK-92细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。6.体内抗瘤试验：第1个模型,MDA-MB453细胞或MDA-MB231细胞接种于BALB／C裸鼠背部皮下,同时尾静脉注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ细胞或未转染的NK-92细胞,比较各组成瘤率。第2个模型,MDA-MB453细胞或MDA-MB231细胞接种于BALB／C裸鼠背部皮下建立裸鼠皮下移植瘤模型。荷瘤小鼠随机分为4组,于第1、8天经尾静脉注射NK-92-scFv-erbB2-CD28-ξ细胞或未转染的NK-92细胞。第2、9天分别取小鼠静脉血用ELISA方法检测其中γ-干扰素(IFN-γ)水平。7.实验动物死后取出皮下移植瘤包块和肺脏,福尔马林固定,石蜡包埋,切片常规HE染色,免疫组化检测CD3、NKG2D、CD56、CD16的表达。 结果：1.成功合成嵌合抗原受体基因并构建其真核表达载体PCDNA3.1(+)-anti-erbB2 scFv-CD28-ξ。2. RT-PCR结果证实了anti-erbB2 scFv-CD28-ξmRNA在NK-92细胞中的表达；流式细胞术检测结果提示NK-92细胞表面嵌合抗原受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ的表达率为18.89%。3.流式细胞术结果显示两种NK-92细胞表面CD27、NKG2D、CD158d、CD85j的表达没有差异。4. anti-erbB2-NK-92细胞对erbB2阳性的MDA-MB453细胞的杀伤率较亲本NK-92细胞至少提高了3倍,这种杀伤作用的增强是抗原特异性的,因为两种NK-92细胞对erbB2阴性的MBA-MD231细胞的杀伤效应没有显著差异。我们还证实Anti-erbB2-NK-92和亲本NK-92细胞对NK细胞敏感的K562细胞的杀伤率同样很高,说明嵌合受体的表达对NK-92细胞的固有细胞毒活性没有影响。5.在体内抗瘤第1种模型里,接种MDA-MB453细胞的裸鼠注射基因修饰的NK-92细胞后成瘤率(第10天)较注射亲本NK-92细胞低,但接种MDA-MB231细胞的裸鼠注射这两种NK-92细胞的成瘤率没有明显差异。在第2种模型里,接受anti-erbB2基因修饰NK-92细胞治疗的荷MDA-MB453肿瘤小鼠的血清IFN-γ水平高于接受亲本NK-92细胞治疗的荷MDA-MB453肿瘤小鼠。而且,与接受亲本NK-92细胞治疗的荷MDA-MB453肿瘤小鼠相比,接受anti-erbB2基因修饰NK-92细胞治疗的荷MDA-MB453肿瘤小鼠的肿瘤体积明显缩小、生存期明显延长、肺转移发生率低、肿瘤组织中有较多淋巴样细胞浸润,经免疫组化证实是NK-92细胞。 结论：1．成功合成嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ基因并构建其真核表达载体；2.通过Amaxa Nucleofector技术实现嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ在NK-92细胞的高表达；3.嵌合受体anti-erbB2 scFv-CD28-ξ在NK-92细胞的表达不影响NK-92细胞的表型特征和固有抗瘤活性；4.在体外,基因修饰的NK-92细胞对erbB2阳性乳腺癌细胞有特异性杀伤；5.在体内,基因修饰的NK-92细胞可以特异性抑制erbB2阳性乳腺癌的生长
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【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2474498