【摘要】： 类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种抗原驱动由CD4+CD28+Th1细胞介导的全身性自身免疫病。鉴于RA病人的滑膜炎症和关节破坏变形与免疫功能的改变密切相关,近年来国外趋向于将具有免疫调节作用的药物作为治疗RA的第一线药,并对RA新的免疫治疗策略进行了广泛的研究。口服耐受就是自九十年代国际上兴起的治疗RA的特异性免疫疗法之一。已有的基础与临床研究结果已经证实口服鸡或牛Ⅱ型胶原蛋白诱导机体产生免疫耐受用于治疗RA这一重要策略的科学性、特异性和可行性。 然而,纵观目前国际上探索免疫耐受策略治疗RA所使用的CⅡ均是天然提取制备的,很难保证提取产物天然结构的完整性和抗原性,也缺乏正确的空间构象和适当的修饰,这样的耐受原由于缺少在构象上相关的表位,难以诱导对应于天然抗原的免疫耐受;而且CⅡ在体内的半衰期较短,病人需要反复给药,从而限制了CⅡ的大规模使用。更况,亦有研究显示,CⅡ并非对所有RA都具有很好的疗效。针对这一重大问题,国际上相继开展了针对CⅡ抗原结构的深入细致研究。随后进一步的研究发现,CⅡ中真正发挥功能的区域是定位于CⅡ-CB11片段中260-270aa,称为CⅡ耐受原表位2(Collagen tolerogenic epitope 2,CTE2),单独给予包含该表位的化学合成或基因重组的多肽能够对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)症状起到缓解作用,并能显著降低血清及关节液中抗CⅡ抗体水平。CⅡ在结构上比较保守,在各物种间都具有相似的表位,而鸡CⅡ在190-200aa处具有另一独特的耐受原表位,在其它物种间并未发现,我们称其为CTE1。这些耐受原表位都含HLA-DR1/DR4的结合位点和与T细胞反应的抗原表位。通过清除T细胞受体表位的不同氨基酸的侧链或替代T细胞结合氨基酸,可以阻断HLA-抗原肽复合物与T细胞形成氢键连接,从而抑制抗原提呈反应,为RA的口服耐受治疗策略提供了深入研究的方向。这也就是近年来国际上十分推崇的耐受原表位肽(Collagen tolerogenic epitopes,CTE)或变构肽(Altered peptide ligand,APL),它们归属于小分子药物生物活性肽中的免疫活性肽类。因此,研制小分子免疫活性肽诸如耐受原表位肽或变构肽进行其治疗则是该研究领域近年来的重大进展之一。的确,在RA动物模型中已经证实化学合成或重组表达的含有这些表位的免疫活性肽具有显著的治疗或缓解作用。尤为突出的是,美国、加拿大两国在2000年已完成APL治疗多发性硬化的Ⅰ\Ⅱ临床试验,目前正在进行Ⅲ期试验。为此,我们先前的研究首次从CCOL2A1中克隆了仅含编码CTE1-2(190-270aa)的基因片段,并设计构建了相应的酵母和原核表达载体。本研究对我室创新性设计构建成的新型重组鸡Ⅱ型胶原特异性耐受原表位肽rcCTE1-2进行了表达条件的优化、纯化鉴定以及对CIA小鼠抑制效应进行了观察,并探索其相应的作用机制。 毋容置疑,本研究的首要关键任务在于成功获得高纯度的rcCTE1-2耐受原表位肽。为此,我们首先对原核表达体系进行了优化,通过摸索调整表达过程中温度、时间、诱导条件,最后得到rcCTE1-2原核表达的最优条件:以1:100接种后,37℃、210rpm振荡培养16h,加入1mM IPTG继续于30℃培养4h,可获得表达量达41%以上的包涵体。此外,在25℃及30℃诱导时还可看到在上清中存在部分的分泌性表达。rcCTE1-2表达菌种采用30%蔗糖高渗溶液进行预处理,经过3次超声破碎后,破菌效果比较彻底,粘度显著降低。包涵体需用含0.5% Triton X-100、2M NaCl及4M尿素的洗涤液洗涤2次效果较好。鉴于rcCTE1-2是被设计成的融合表达,我们采用金属螯合层析的方法,利用Ni-NTA树脂可与组氨酸标签特异性结合的特性,一步即可获得高纯度的rcCTE1-2。并利用柱上复性结合透析复性的方式对其进行复性得到可溶性的rcCTE1-2。经Western-blot分析表明,所纯化的rcCTE1-2可以和抗CⅡ单抗产生特异性结合,由此证明我们所表达纯化的rcCTE1-2仍保持具有活性的功能表位。 我们知晓,胶原蛋白的合成是一个非常复杂的过程,它涉及翻译后加工、糖基化等诸多种步骤,至少需要8种酶的参与。其中以脯氨酸羟化酶P4Hα、β两个亚基的羟化作用尤为重要,它能使特异的胶原三肽重复序列Gly-X-Pro的脯氨酸残基羟基化。羟化脯氨酸对于在生理条件下形成稳定的胶原三螺旋是必需的。而由本研究室所构建成功的rcCTE1-2原核表达载体是在大肠杆菌中表达的,与真核表达载体相比缺乏翻译后的修饰,即无羟基化与糖基化。这种缺乏翻译后修饰的重组胶原蛋白是否具有生物学功能?能否在小鼠体内诱导有效地免疫耐受?其诱导耐受的机制如何?将是本研究中最为关注的问题。因此我们采用天然CCⅡ在AMMS/1雌性昆明小鼠中建立CIA模型,该模型的四肢关节肿胀程度、组织病理学表现,血清内抗CⅡ抗体水平与RA极为相似,完全符合RA模型体内实验治疗的标准要求。体内实验结果表明,胶原免疫28d后,50μg/kg rcCTE1-2组与50μg/kg nCCⅡ均可明显减轻四肢关节肿胀程度,与其它组比较差异有统计学意义(P0.05)。而与50μg/kg nCCⅡ组相比,50μg/kg rcCTE1-2组在抑制关节肿胀方面效果更好(P0.05)。组织病理学检查结果显示,CIA阳性对照组关节腔内有明显血管翳形成,滑膜增生,大量炎性细胞浸润,关节软骨变薄且失去完整性,几乎观察不到完整的骨小梁,骨髓腔内分布大量的破骨细胞。50μg /kg nCCⅡ预防组和50μg/kg rcCTE1-2预防组滑膜增生减弱,炎性细胞浸润明显减少,少见纤维物质沉淀,基本看不到软骨及骨的改变。而其余剂量组与阳性对照组相比没有显著改变。对CIA小鼠血清内抗CⅡ抗体水平检测结果显示,与CIA阳性对照组相比,nCCⅡ与rcCTE1-2各剂量组都能够降低小鼠体内抗CⅡ抗体水平,而只有50μg/kg nCCⅡ组和5μg/kg、50μg/kg rcCTE1-2组与阳性对照组相比具有统计学差异(P0.05)。抗CⅡ抗体被认为是反映关节炎严重程度最可靠的指标,其水平反映了RA早期阶段炎症和骨质破坏的程度。由此证实,未经翻译后修饰的rcCTE1-2能够有效地预防CIA的发生及关节炎症状的严重程度。 为了进一步探索rcCTE1-2预防CIA的机制,在nCCⅡ免疫38d后,我们分离了50μg/kg nCCⅡ和rcCTE1-2两组小鼠脾细胞,检测其培养上清液中Th3因子TGF-β及Th1因子IFN-γ含量。研究结果表明,nCCⅡ预防组与rcCTE1-2预防组脾细胞上清液中IFN-γ含量与CIA组相比都有显著下降(P0.01),而rcCTE1-2组比nCCⅡ组具有更显著的效应(P0.05),CIA对照组的IFN-γ含量显著高于阴性对照组(P0.01)。TGF-β检测结果显示,nCCⅡ预防组与rcCTE1-2预防组TGF-β分泌明显高于CIA组与阴性对照组(P0.01),rcCTE1-2组又显著高于nCCⅡ组(P0.05)。上述结果提示,50μg/kg rcCTE1-2和nCCⅡ都能够对CIA小鼠细胞因子的分泌起到一定的调节作用,其机制可能为通过下调Th1型细胞因子的同时上调Th2型细胞因子的分泌来有效控制并减缓CIA的发生与发展的。 总之,本研究在原核表达系统中表达并纯化出同时携带两个耐受原表位的新型重组耐受原表位肽rcCTE1-2,经CIA小鼠模型证实其能有效预防CIA发病率与发病严重程度,对其机制进行了一定的探讨,为今后临床进一步研究和应用奠定了基础,也为类风湿性关节炎的治疗提供了更多更广的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392
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本文编号：
2486481
