β2糖蛋白I的纯化及其多克隆抗体制备与初步应用

发布时间：2019-06-01 21:15

【摘要】： 目的:获得高纯度人血浆β2糖蛋白I(β2GPI),制备兔抗人β2GPI多克隆抗体,为进一步研究β2GPI及其抗体在抗磷脂综合征(APS)病理机制中的作用奠定基础。方法:1.采用HClO_4沉淀、Heparin Sepharose CL-6B亲和层析等方法纯化人血浆β2GPI;利用SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析提纯蛋白的纯度;观察不同温度、NaCl浓度及防腐剂等条件下的β2GPI稳定性。2.以纯化的β2GPI作为抗原免疫新西兰大白兔,获得抗血清;进而利用Protein A及β2GPI亲和层析柱纯化抗血清中的总IgG及抗β2GPI抗体;采用免疫双向扩散试验(IDD)、ELISA和免疫印迹等方法进行抗体验证。3.应用人β2GPI及其多克隆抗体共同刺激单核细胞株THP-1,检测其组织因子(TF)活性表达情况;利用β2GPI亲和层析柱,初步分析β2GPI与单核细胞株THP-1表面膜联蛋白A2(Annexin A2)的结合情况。结果:1.本法获得了高纯度目的蛋白β2GPI(＞95%)。β2GPI在低于0.8 mol/L NaCl溶液中室温及4℃保存易降解变性,但在1.6mol/L NaCl溶液中室温及4℃保存60天均未见蛋白明显降解。2.IDD及ELISA鉴定抗血清及总IgG效价分别达到1:16和1:100000;免疫印迹显示纯化的总IgG和抗β2GPI抗体与β2GPI蛋白均有特异反应条带;3.β2GPI及其多克隆抗体形成的复合物能够刺激单核细胞株THP-1表达TF活性;免疫印迹实验表明,来自THP-1细胞的Annexin A2能够与β2GPI亲和柱结合。结论:1.通过本研究,简单方便地获得了高纯度人血浆β2GPI;在使用和保存β2GPI时要考虑到其降解的可能性,注意保存条件,必要时冻干保存。2.通过免疫动物及亲和层析方法,成功获得了兔抗人β2GPI多克隆抗体。3.应用制备的β2GPI亲和层析柱,证明了β2GPI可以结合单核细胞株THP-1表面的Annexin A2;β2GPI与其抗体复合物能够刺激THP-1细胞表达TF活性,是导致APS高凝状态的重要机理之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】