L-精氨酸—一氧化氮途径对病理性心肌肥大形成的抑制作用及相关机制

发布时间：2019-06-24 16:51

【摘要】： 病理性心肌肥大既是高血压、心脏瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等临床常见疾病的一种并发症,亦是影响心血管疾病发病率和死亡率的独立危险因子。有研究发现在心肌肥大人群中心血管事件的发生率是无心肌肥大者的2~4倍。病理性心肌肥大的持续进展将导致严重的心律失常和心力衰竭,严重影响心血管病患者的预后。基于此,对病理性心肌肥大发生机制的探讨并寻找有效的干预措施,具有十分深远的临床意义。近年来,对心肌肥大时心脏的功能学变化及细胞内基因表达模式的改变已有比较深入的研究,但对心肌肥大发生的具体机制还不甚清楚。目前认为心肌肥大是心脏对多种病理刺激的一种适应性反应,其形成与压力负荷增加、神经内分泌系统功能异常密切相关。研究证实神经内分泌系统产生的多种细胞因子,如血管紧张素、去甲肾上腺素、内皮素及血小板源性生长因子等,与相应受体结合后能够级联激活多种信号转导途径,如JAK-STAT途径、丝裂原活化蛋白激酶途径及钙调神经磷酸酶途径等,随后诱发核内原癌基因的转录活化,显著改变细胞行为特异性基因的表达水平,从而引起一系列生长、增殖、分化等细胞效应。在此过程中,亦有多种细胞因子如一氧化氮、缓激肽等参与对上述细胞效应的负反馈调节过程,从而使细胞行为处于复杂的调控网络之中。形态学研究已经指出,心肌肥大发生时心肌细胞发生了显著的表型变化,同时伴有非心肌细胞的增殖。有鉴于此,开展关于信号分子及其后续信号转导途径的研究,对于深入认识心肌肥大发生机制和探寻有效干预措施的意义不言而喻。近年来发现L-精氨酸可在体内多种细胞所表达的一氧化氮合酶催化下,生成一氧化氮及L-瓜氨酸,该过程即L-精氨酸-一氧化氮途径。心脏中的一氧化氮,除具有扩张冠脉、增加冠脉血流量、降低心肌收缩力等效应外,可能在抑制和逆转心肌肥大形成的过程中起重要作用。本实验利用腹主动脉缩窄大鼠模型及离体心肌细胞,从整体水平、细胞水平及分子水平分别探讨心肌肥大发生时及其发生受到L-精氨酸-一氧化氮途径影响后胞外刺激分子的合成变化、胞内分子信号转导与核内特异性基因表达模式的改变,从而阐释病理性心肌肥大与多个信号分子之间的关系以及L-精氨酸-一氧化氮途径对心肌肥大的作用和相关机制。 1大鼠腹主动脉缩窄模型的制备及其效果的探讨探讨、改进大鼠腹主动脉缩窄模型的制备术式并探究对大鼠腹主动脉的合适缩窄程度。对两组大鼠分别施行传统术式与改良术式,然后用改良术式将另外四组大鼠的腹主动脉内径分别缩窄至0.5mm、0.6mm、0.7mm和0.8mm,对比评价各组的存活率以及造模效果。结果显示:(1)改良术式组大鼠术后存活率90.00% (27/30)显著高于传统术式组66.67% (20/30);(2) 0.8mm组大鼠存活率86.67% (26/30)显著高于0.7mm组63.33% (19/30), 0.6mm组43.33% (17/30)及0.5mm组3.33% (1/30);(3) 0.8mm组与0.7mm组两组大鼠的平均动脉压、左心室重量指数、左心室室壁厚度以及心肌细胞直径均无显著性差异。以上结果证实,采用改良术式将腹主动脉在结扎点处的内径缩窄至0.8mm,与将其内径缩窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比,能在不影响造模效果的前提下,提高大鼠模型的存活率。 2 L-精氨酸-一氧化氮途径负向调控血管紧张素II及其1型受体的表达水平本实验利用腹主动脉缩窄的大鼠模型及培养的心肌细胞,从在体和离体水平分别研究心肌内蛋白合成总量与心率、血压、心肌内一氧化氮(NO)和血管紧张素II(Angiotensin II,ATII)含量的关系,以及NO前体物质L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)对上述指标和心肌一氧化氮合成酶(NO Synthase, NOS)、血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme, ACE)与ATII受体表达的影响,进而探讨L-精氨酸对病理性心肌肥大的影响作用及相关机制。实验动物分四组:(1)假手术组;(2)手术组:按前述方法造成大鼠腹主动脉的机械性缩窄;(3)L-Arg组:腹主动脉缩窄术后即灌饲L-Arg 600mg/kg?day-1;(4)L-硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)组:腹主动脉缩窄术后同时灌饲L-Arg 600mg/kg?day-1及L-NAME 50 mg/kg?day-1。术后6周,测量各组大鼠心率、血压、左心室重/体重比值、左室心肌蛋白合成总量和NO、ATII的含量以及ACE mRNA的表达量。离体培养的心肌细胞亦分四组:(1)对照组:分离培养乳鼠心肌细胞,无处理因素;(2)ATII组:分离培养心肌细胞72小时后,培养液加入ATII(终浓度0.1μmol/L);(3)ATII+L-Arg组:分离培养心肌细胞72小时后,培养液同时加入ATII(终浓度0.1μmol/L)和L-Arg(终浓度100μmol/L);(4)ATII+L-Arg+L-NAME组:分离培养心肌细胞72小时后,培养液同时加入ATII(终浓度0.1μmol/L)、L-Arg(终浓度100μmol/L)和L-NAME(终浓度15μmol/L)。施加处理因素后48小时,收集各组心肌细胞,检测NO生成量、诱导型一氧化氮合成酶(inducible NO synthase, iNOS)mRNA和蛋白水平的表达量,以及ATII的1型受体(ATII receptor type 1, ATR1)、2型受体(ATII receptor type 2, ATR2)mRNA的表达量。结果显示:(1) L-Arg提高了腹主动脉缩窄大鼠心肌内NO含量,降低了心肌ATII含量、心肌蛋白合成总量、左心室重/体重比值以及ACE mRNA的表达量;L-NAME可消除L-Arg的上述作用;(2)在离体条件下,与ATII组相比,ATII+L-Arg组心肌细胞NO含量、iNOS mRNA及蛋白水平的表达量均有提高, ATR1 mRNA表达水平下降;ATII+L-Arg+L-NAME组与ATII组就上述指标相比无显著性差异;各组细胞ATR2 mRNA表达水平无明显差异;(3)多元逐步回归分析显示心肌内蛋白合成总量与血压水平、心率之间均不存在回归关系,而心肌NO和ATII含量则可作为心肌内蛋白合成总量的预测因子;(4)心肌内ATII含量、ACE mRNA表达量及心肌细胞ATR1 mRNA表达量均与NO含量之间存在线形负相关关系。以上结果证实:(1)心肌肥大的形成与心肌内NO、ATII含量密切相关;(2) L-Arg通过增强心肌iNOS表达,致NO生成增加。NO可减少心肌内ATII生成,并通过调控心肌ACE及ATR1表达来抑制病理性心肌肥大的形成;(3) ATR2并未参与上述过程。 3 L-精氨酸-一氧化氮途径抑制丝裂原活化蛋白激酶途径的磷酸化激活在离体培养心肌细胞发生肥大反应时,探讨L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)对心肌细胞血管紧张素II受体(Angiotensin II Receptor, ATR)及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)表达的影响,进而阐明MAPK在心肌肥大发生中的作用以及L-Arg对心肌细胞肥大反应的影响作用和相关机制。用血管紧张素II (angiotensin II, ATII)、ATR抑制剂Saralasin、L-Arg和L-NAME (L-硝基精氨酸甲酯)分别作用于心肌细胞,实验分组:(1)对照组:无处理因素;(2) ATII组:培养液中加入ATII (终浓度0.1μmol·L 1);(3) ATII + Saralasin组:培养液同时加入ATII (终浓度0.1μmol·L 1)和ATII受体抑制剂Saralasin (终浓度0.1μmol·L 1); (4) ATII + L-Arg组:培养液中同时加入ATII (终浓度0.1μmol·L 1)和L-Arg (终浓度100μmol·L 1);(5) ATII + L-Arg + L-NAME组:培养液中同时加入ATII (终浓度0.1μmol·L 1)、L-Arg (终浓度100μmol·L 1)和L-NAME (终浓度15μmol·L 1)。然后以[3H]-亮氨酸掺入法检测细胞蛋白合成速率、比色法检测一氧化氮(NO)生成量、RT-PCR及Western blotting检测ATR及p38 MAPK的表达水平。结果显示:(1)给予L-Arg可缓解ATII引起的心肌细胞NO合成量下降,减弱血管紧张素II-1型受体(Angiotensin Receptor Type 1, ATR1)表达及下调p38 MAPK蛋白磷酸化水平,并降低心肌细胞蛋白合成速率;(2) ATR抑制剂Saralasin在降低ATR1表达水平的同时显著下调p38 MAPK的蛋白磷酸化水平,总P38 MAPK表达水平未见明显变化;(3)心肌ATR1表达水平及p38 MAPK蛋白磷酸化水平均与NO合成量之间存在线性负相关关系。多元逐步回归分析显示在ATR1与ATR2中,仅ATR1的表达水平与p38 MAPK蛋白磷酸化水平之间存在回归关系。以上结果证实:(1) p38 MAPK的磷酸化激活经由ATR1介导;(2) L-Arg可致心肌细胞NO合成量增加,后者可抑制ATR1介导的p38 MAPK蛋白磷酸化水平上调,进而抑制心肌细胞肥大反应;(3) ATR2未参与p38 MAPK的磷酸化激活过程。 4 L-精氨酸-一氧化氮途径抑制钙离子介导的钙调神经磷酸酶途径的活化利用急性分离的心肌细胞,探讨L-精氨酸对胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)及钙调神经磷酸酶(Calcineurin, CaN)表达的影响,进而阐述CaN途径在心肌肥大发生中的作用及其与L-精氨酸-一氧化氮途径之间的关系。腹主动脉缩窄的术式及实验动物分组如前所述:(1)假手术组;(2)手术组:按前述方法造成大鼠腹主动脉的机械性缩窄;(3)L-Arg组:腹主动脉缩窄术后即灌饲L-Arg 600mg/kg?day-1;(4)L-NAME组:腹主动脉缩窄术后同时灌饲L-Arg 600mg/kg?day-1及L-NAME 50 mg/kg?day-1。6周后,取各组大鼠心脏,利用Bradford法检测左室心肌总蛋白含量,并以比色法检测NO生成量。急性分离各组大鼠的心肌细胞,以荧光测定法检测胞内游离钙离子浓度;并运用RT-PCR检测CaN和胚胎期特异性基因心房利钠因子(atrial natriuretic factor, ANF)的表达水平。以胚胎基因ANF表达水平显著上调作为心肌肥大形成的标志。结果显示:(1)在手术组大鼠的心肌细胞内,钙离子浓度及CaN的表达水平显著升高,胚胎基因ANF表达明显增强;(2)与手术组大鼠心肌细胞相比,在L-Arg组,心肌细胞内钙离子浓度及CaN的表达水平显著降低, ANF表达水平亦明显下调;(3)在L-NAME组,观察到L-NAME可取消L-Arg的上述效应;(4)相关分析显示,心肌NO含量分别显著负相关于心肌细胞内钙离子浓度、CaN及ANF表达水平;相反地,左室心肌总蛋白含量与心肌细胞内钙离子浓度之间、与心肌细胞CaN表达水平之间分别具有显著的线性正相关关系。以上结果证实:(1)心肌细胞内游离钙离子浓度与CaN的表达水平是参与心肌肥大形成过程的重要因素;(2) L-精氨酸-一氧化氮途径可显著降低心肌细胞内的游离钙离子浓度并下调CaN的表达水平,抑制CaN途径的活化。结论 1与传统术式相比,改良术式能够提高腹主动脉缩窄术后动物模型的存活率。 2采用改良术式将腹主动脉在结扎点处的内径缩窄至0.8mm,与将其内径缩窄至0.7mm、0.6mm或0.5mm相比,能在不影响造模效果的前提下,提高大鼠模型的存活率。 3心肌肥大的形成与心肌内NO、ATII含量密切相关;L-精氨酸通过增强心肌iNOS表达,致NO生成增加。NO可减少心肌内ATII生成,并通过调控心肌ACE及ATR1表达来抑制病理性心肌肥大的形成。 4 ATR2未参与ATII和L-精氨酸分别介导的心肌肥大形成与消退过程。 5 ATR1介导p38 MAPK的磷酸化激活过程。 6 L-精氨酸-一氧化氮途径可抑制ATR1介导的p38 MAPK蛋白磷酸化水平上调,进而抑制心肌细胞肥大反应。 7心肌细胞内游离钙离子浓度与CaN的表达水平是参与心肌肥大形成过程的重要因素。 8 L-精氨酸-一氧化氮途径可显著降低心肌细胞内的游离钙离子浓度并下调CaN的表达水平,抑制CaN途径的活化。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R363

【参考文献】