人DC-SIGN基因RNAi慢病毒载体的构建及功能学鉴定

发布时间：2019-06-25 07:58

【摘要】： 树突状细胞特异性细胞间黏附分子- 3 -结合非整合素( dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3 grabbing nonintergrin, DC-SIGN)是树突状细胞(dendritic cells,DCs)表面的一种新型凝集素受体[1],在调节树突状细胞黏附、迁移,激活初始T淋巴细胞,启动免疫应答,以及病原体的免疫逃逸等多方面发挥重要作用[2-6],是结核病干预策略中的新靶标。DC-SIGN是DCs表面结核杆菌的主要受体。结核杆菌可通过其胞壁成分--带甘露糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan, ManLAM)与DC-SIGN分子结合,抑制DCs成熟[7-10]。DCs在抗结核免疫应答中发挥着中心作用,它是唯一能激活初始T细胞,启动初始免疫应答的抗原提呈细胞[6,8]。而DCs要发挥活化初始T细胞的作用,其前提是必须成熟。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种可高效、特异地下调目标基因的表达并在基因功能研究和基因治疗领域有着广阔的应用前景的技术[11,12]。慢病毒表达载体是RNAi常用的载体之一,能将自身携带的片断整合入宿主细胞基因组,在哺乳动物各类细胞稳定表达小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),长期抑制基因表达[13]。 本研究根据人DC-SIGN基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成双链DNA,并经PCR扩增、DNA测序以及外源性筛选,确定RNAi有效靶序列,构建并包装产生人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表达载体。利用构建成功RNAi慢病毒表达载体转染人外周血单核细胞诱导分化而来的DCs,通过流式细胞仪、RT-PCR以及Western blot检测DCs表面DC-SIGN分子表达水平变化,流式细胞仪检测DCs表面成熟标志物HLA-DR及CD86水平,ELISA检测DCs培养上清液中IL-12、IL-10分泌水平,混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力。通过以上研究以明确慢病毒表达载体介导的RNA干扰对DCs表面DC-SIGN分子表达水平的抑制程度以及对DCs成熟度和功能的影响。 研究结果:PCR扩增和DNA测序结果证实,DC-SIGN核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条有效靶序列。选择其中一条有效靶序列包装慢病毒,产生浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10 9 T U/mL。利用人DC-SIGN基因RNAi慢病毒表达载体转染DCs,流式细胞术、PCR及WB检测均提示DCs表面DC-SIGN表达水平降低,流式细胞仪显示各组间成熟标志物HLA-DR及CD86差异无统计学意义,ELISA结果显示各组DCs培养上清液中IL-10、IL-12水平差异无统计学意义,混合淋巴细胞反应结果显示各组DCs诱导CD4+T淋巴细胞增殖能力差异无统计学意义。 研究结论:本研究建立了一种稳定、有效的转染人外周血单核细胞来源的DCs的方法,并能在体外细胞水平有效抑制DC-SIGN表达,慢病毒表达载体转染后的DCs能保持其原有的形态、生长特性、成熟表型及免疫学功能。这为我们后续研究人DC-SIGN分子水平调控对下游抗结核免疫应答功能的影响奠定了基础,对进一步明确人DC-SIGN分子在结核病发病机制中的作用也有帮助,为结核病以及其它相关疾病的预防和治疗提供了新的思路。
[Abstract]:The dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-binding non-integrin (DC-SIGN) is a novel lectin receptor[1] on the surface of a dendritic cell, The important role of initiating immune response and immune escape of pathogens[2-6] is a new target in the intervention strategy of tuberculosis. DC-SIGN is the main receptor of Mycobacterium tuberculosis on the surface of DCs. The tubercle bacillus can be combined with the DC-SIGN molecule through its cell wall component, such as the mannoose-capped liposia binomannan, and the ManLAM, to inhibit the maturation of the DCs[7-10]. The DCs play a central role in the anti-tuberculosis immune response, which is the only one that can activate the initial T-cells, The antigen presenting the initial immune response is cell[6,8]. DCs need to play the role of activating the initial T cells, provided that it is necessary to mature. RNA interference (RNAi) is an efficient and specific down-regulation of target gene expression and has a wide application prospect in the field of gene function research and gene therapy[11,12]. The lentiviral expression vector is one of the commonly used vectors of RNAi, which can integrate the self-carried fragments into the host cell genome, stably express small-molecule interference RNA (siRNA) in various mammalian cells, and inhibit gene expression for a long time[13]. In this study, four target sequences were selected according to the mRNA sequence of the human DC-SIGN gene, the double-stranded DNA was designed and amplified by PCR, the DNA sequencing and the exogenous screening, the effective target sequence of RNAi was determined, and the lentiviral expression of the human DC-SIGN gene was constructed and packaged. The expression of DCs on the surface of DCs was detected by flow cytometry, RT-PCR and Western blot. The expression of DCs-SIGN in the surface of DCs was detected by flow cytometry, RT-PCR and Western blot. The levels of IL-12 and IL-10 in the supernatant of the supernatant of DCs were detected by ELISA, and the proliferation of T-lymphocytes stimulated by DCs was detected by the mixed lymphocyte reaction. The ability of the above-mentioned studies to determine the degree of inhibition of the expression level of DC-SIGN molecules on the surface of DCs and to the maturity and function of DCs by clear lentiviral expression vector-mediated RNA interference The results of the study: The results of PCR and DNA sequencing confirmed that the sequence of the DC-SIGN nuclear acid chain was correctly inserted and the exogenous screening determined the two. Effective target sequence. Select one of the effective target sequences to package the lentivirus to produce a concentrated lentivirus suspension with a titer of 1 to 10 9 T U/ mL. The expression level of DC-SIGN in the surface of DCs was decreased by using human DC-SIGN gene RNAi lentiviral expression vector. The results showed that the expression of DC-SIGN in the surface of DCs was decreased by flow cytometry, and the difference of HLA-DR and CD86 among the groups was not statistically significant by flow cytometry. The results showed that there was no significant difference in the expression of HLA-DR and CD86 among the groups. There was no significant difference in the level of IL-10 and IL-12. The results of mixed lymphocyte reaction showed that there was no difference in the proliferation of CD4 + T lymphocytes induced by DCs in each group. The results of the study: This study established a stable and effective method for the transfection of DCs from the peripheral blood mononuclear cells of human peripheral blood, and can effectively inhibit the expression of DC-SIGN in the in vitro cell level, and the DCs transfected with the lentiviral expression vector can retain their original cells. the form, the growth characteristic, the maturity, Phenotypic and immunological function. This provides a basis for the effect of DC-SIGN molecular level regulation on the function of anti-tuberculosis immune response in the downstream. It is also helpful to further clarify the role of human DC-SIGN in the pathogenesis of tuberculosis and to prevent and treat tuberculosis and other related diseases.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

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本文编号：2505526