PEG修饰鼠抗人CD3单克隆抗体的研究

发布时间：2019-08-02 11:19

【摘要】： 目前,抗CD3单克隆抗体已广泛应用于临床治疗器官移植后排斥反应,疗效显著,但机体易产生特异性免疫反应,导致鼠源性抗CD3单克隆抗体被快速清除,半衰期明显缩短,从而限制了其治疗作用。PEG修饰蛋白是蛋白类药物二次开发中的一项热点技术,PEG与药物相连,能有效延长药物的半衰期,降低药物的免疫原性。本文利用PEG修饰鼠源性抗CD3单克隆抗体,拟有效改善其生物学活性,提高临床应用效果。 本实验首先以胃蛋白酶酶解鼠抗人CD3单克隆抗体,然后通过凝胶层析分离及超滤纯化得到抗体Fab′,并利用SDS-PAGE检测纯度。通过单因素试验确定胃蛋白酶与抗体的物质量之比为2:100,消化24h,反应体系pH值为3.0及温度为37℃的酶解条件,以及巯基乙醇摩尔浓度为0.1mol/L,消化30min的F(ab′)2制备Fab′抗体反应条件。结果得到纯度较高的抗体Fab′,并利用薄层扫描纯度均达到95%以上。 接着利用PEG—SPA修饰抗体和抗体片段Fab′,并对鼠抗人抗CD3单克隆抗体和抗体片段的PEG化反应条件进行了优化。通过正交确定了较佳的修饰工艺条件。结果表明,在pH9.0硼酸缓冲液,反应温度25℃,抗体浓度0.2mg/ml,抗体和PEG摩尔比为1:20,反应3小时,所得到的修饰效果最好。 其次通过PEG化抗体IgG和抗体片段Fab′的体内以及体外T细胞增殖实验,考察了修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性,实验结果显示:修饰后抗CD3单抗全抗,对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.28%,抗体Fab′下降了7.96%,PEG化Fab′下降了19.92%,其对T细胞抑制率有所下降,但细胞毒性增强不明显。 最后利用ELISA法测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期。结果显示:mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓,修饰后抗CD3抗体半衰期从2.658347h延长到8.722217h,延长了3.28倍。而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.209713h延长到4.1723h,延长了1.895倍。 由此我们可发现,利用低分子量的PEG修饰抗体,降低抗体本身的免疫原性,延长其半衰期这一方法,具有较好的可行性,且可极大的提高单克隆抗体尤其是非人源性抗体在临床上的应用。
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性所致的排斥反应一直是限制其临床应用的重要原因【闪。用蛋白酶水解完整抗体得到的Fab片段由于去除了Fc段[65]，因而大大降低了人抗鼠异种蛋白排斥反应，减少了过敏反应的发生，提高了疗效。抗体结构和酶解示意图如图2一1所示:图2一1抗体结构示愈图FigZ一IThede肚neationofan廿bodystructoreFab片段是由重链Fd(即vM祀Hl)和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合部位。与全抗体相比具有许多优势【661，例如:(l)不受位于巨噬细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和巨细胞等细胞上的Fc受体的影响;(2)不沉淀抗原;(3)比F(ab，)2更易制备和纯化;(4)在正常组织中分解放射性标记片段比整个IgG偶联物更快;(5)降低免疫原性(Fc区缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反应最小化;(6)更不易遭到吞噬细胞攻击;(7)分子量小，到达肿瘤部位迅速，故已成为最新的研究热点。2.2材料与方法2.2.1试剂与材料鼠抗人CD3单克隆抗体:北京天广实生物技术有限公司;Se帅adexG一75:瑞典 AmershamBioseiences;甘氨酸(生化试剂):上海康捷生物科技发展有限公司;

pH为4.0，温度为37，C。考察反应时间对酶解产物F(ab，)2得率的影响。F(ab’)2得率计算公式如下:F(ab恤得率=F(ab’)2产t八gG投入t‘100%由图2一6可知，酶解反应24h，抗体已基本酶解完全， sDS识AGE凝胶电泳图上，，全抗条带己基本上没有，时间继续延长对得率影响变化不大，且考虑到反应时间太长会影响F(ab，)z的稳定性，选定胃蛋白酶酶解反应时间为24h。卜‘嘴)}.//尸—’。}~/////l

本文编号：2522083