人血浆凝血因子V的纯化和单克隆抗体细胞株的建立

发布时间：2019-08-06 07:48

【摘要】： 目的本研究旨在建立一种从新鲜冰冻血浆中提取凝血因子V(Coagulation factor V,FV)的方法,并用提取的FV为抗原免疫小鼠,以建立抗人FV单克隆抗体细胞株,为利用FV单克隆抗体研制FV检测试剂做准备。 方法(1)通过对实验温度、时间和加入血浆中的酶抑制剂的选择,探索能够保持FV稳定的纯化条件;采用柠檬酸钡吸附、聚乙二醇6000分级沉淀,对血浆进行预处理,获得富集FV的血浆;通过DEAE-Sepharose FF离子交换层析提取FV;利用Sephacryl-S300凝胶过滤层析获得纯度较高的FV;超滤浓缩后加保存液冻存。(2)以纯化的人FV为抗原免疫BALB/c小鼠,将免疫后的小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,HAT选择培养基筛选培养;用间接酶联免疫吸附试验筛选出抗人FV阳性细胞株,对杂交瘤细胞进行亚克隆并进行细胞染色体核型分析,筛选可稳定分泌FV单克隆抗体细胞株。 结果-80℃存放的新鲜冰冻血浆转4℃放置5h,37℃水浴快速融化后再转至4℃,添加蛋白酶抑制剂,整个纯化过程控制在4℃进行,能较好的保持FV的稳定和回收率。电泳图谱显示:添加二异丙基氟磷酸(DFP)要比未加DFP获得的未降解FV多。经过对血浆预处理和两步层析后,FV活性回收率为11.21±3.54%,比活性为30.46±0.31U/mg,浓缩倍数为2538.33±25.83倍。初步建立起4株分泌抗人FV的单克隆抗体细胞株,命名为AFV 001～004。 结论①本实验设计的纯化方法能够较有效的浓缩人血浆中的FV,并制备出较高纯度的FV;②初步建立起抗人FV的单克隆抗体细胞株。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：2523419