CLM3和CLM5促进TOLL样受体（TLR）触发巨噬细胞天然免疫应答反应及其相关分子机制的研究

发布时间：2019-08-10 12:59

【摘要】： 上篇CMRF35样分子3(CLM3)促进TLR9触发的巨噬细胞产生炎性细胞因子及其相关分子机制研究免疫识别与免疫调节的细胞与分子机制是当前免疫学研究的重要领域。天然免疫系统是机体抗细菌、病毒等病原体入侵的“第一道防线”,而TOLL样受体(Toll-like receptors, TLRs)以及表达TLRs的巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞是天然免疫的重要的组成部分,有关TLR参与巨噬细胞免疫识别的机制以及触发的免疫应答反应和信号转导过程的调节机制、特别是对于TLR信号转导的调控机制尚不十分清楚,因此,参与TLR信号转导的新的分子机制的研究备受瞩目。作为机体重要的模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRR),TLRs主要表达于免疫细胞包括树突细胞、巨噬细胞和中性粒细胞、淋巴细胞表面。TLRs通过识别表达在细菌、病毒和真菌组成物上广谱的病原体相关分子模式,启动宿主抗感染的天然免疫反应。识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)后,TLRs招募胞浆内一系列含有TIR区域的接头蛋白,如MyD88、TIRAP (又称作MAL)、Trif (又称作TICAM1)和TRAM (又称作TICAM2)。除TLR3外,TLRs家族的所有成员都可以通过MyD88依赖途径活化,MyD88可通过活化下游的MAPKs和NF-κB来调控炎性细胞因子的分泌。TLR3和TLR4可通过活化TRIF依赖的途径活化NF-κB, MAPKs和IRF3,诱导TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNβ等细胞因子。TLRs信号过度活化或负向调控不足会导致严重的免疫相关性疾病和炎症性疾病,如果活化不足将导致严重的免疫缺陷。目前已发现的一些正向调控因子,如DC-SIGN、Ras等,和负向调控因子,如A20、SHIP-1、ST2等,为维持TLRs介导的免疫应答稳定性发挥了重要的作用。由于TLRs信号转导对天然免疫及获得性免疫均具有重要的调节作用,TLRs信号转导机制的研究对于阐明机体免疫反应产生的机理、寻找免疫调节治疗的新途径具有重要意义,因此TLRs参与免疫识别与免疫调节的机制研究是当前免疫学研究的前沿热点。我们研究的CLM家族分子,其最早发现是源于CMRF35-A单抗识别的一个淋巴细胞表面抗原,该抗原分子属于IgSF超家族成员,含有单链的免疫球蛋白可变区的胞外段,跨膜段和胞内段,基因定位于人17号染色体。后来证明,此抗CMRF-35的单克隆抗体还能识别CMRF-35分子的同源分子,这些分子结构与CMRF-35相似,可变区与CMRF-35同源,在17号染色体上成簇分布(cluster)因而命名为CD300家族。其相应的小鼠同源分子命名为CLM(CMRF-35-Like Molecule,CLM)家族。鼠CMRF35样分子超家族含有9个成员,位于鼠第11号染色体上,CLM1-8非常紧密地位于11E2区的250kb左右的区域,而CLM9与其他家族成员分离,位于11D区。CLM家族成员与免疫应答、炎症及变态反应关系密切,首先, CLM家族成员主要表达在参与固有免疫应答的髓系免疫细胞表面,有些成员如CLM4在脾脏等免疫器官高表达,还有如CLM5在与外来抗原直接接触的气道和肺脏高表达;其次,多数活化性受体成员如CLM5、CLM7、CLM8在抗体交联活化后能促进中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞分泌炎性因子,而抑制性受体成员如CLM1或CLM8则抑制炎性反应或免疫细胞应答;再次,许多受体成员如CLM1/5,CLM4/8,在炎症因子等外来刺激的细胞表面表达发生变化,提示在炎症反应过程中起一定的正向和负向调控作用。CLM分子参与TLRs免疫识别与应答的调节机制是值得研究的重要课题,目前基本上属于空白点。 CLM3作为CLM家族的成员,其特征和功能都没有相关报道,本研究中我们从小鼠腹腔巨噬细胞中成功克隆了CLM3的全长基因,长738bp碱基,编码245个氨基酸(a.a)的蛋白质,推测分子量为27kDa。对其氨基酸序列分析表明,该蛋白含有长17a.a的信号肽和22a.a的疏水跨膜区,胞外段含有特征性的IgV功能域(domain),属于Ig超家族成员,CLM3定位于小鼠11号染色体的11E2区, CLM1-8非常紧密地位于该区,而CLM9与其他家族成员分离。同源性比对发现与CLM3同源性较高的均为CLM家族成员,其中与CLM5和CLM1同源性最高,胞外段一致性为85%。 RT-PCR分析表明,CLM3广泛分布于小鼠正常组织,在心、肝、脾及淋巴结等组织均有不同程度表达,其中尤以淋巴结表达水平最高,在P815、Crip、RF、CT26、YAC-1、A20、3LL、Hepa、RAW264.7等细胞株中,CLM3仅在RAW264.7巨噬细胞株中表达,在新鲜分离的小鼠原代的细胞中,亦验证了此结果,CLM3仅在腹腔巨噬细胞中表达,这种在组织细胞的分布特点提示该分子在免疫防御中可能的功能。由于许多炎性因子可以通过影响具有调控功能的分子的表达进而调控细胞的应答,因此我们在本研究中观察了TLRs配体LPS、polyI:C、CpG ODN对CLM3分子表达的影响,然而LPS(0.1μg/ml剂量刺激)、polyI:C(0.1μg/ml剂量刺激)、CpG ODN(0.3μM剂量刺激)刺激至24小时,Raw264.7细胞中CLM3 mRNA的表达无明显变化。 CLM3究竟有何功能?是否同其他CLM家族成员一样在免疫与炎症中发挥重要作用?是否也参与了TLRs的信号转导? 我们发现,CLM3能促进CpG ODN诱导的炎性细胞因子(TNFα和IL6)的产生。我们将CLM3 siRNA转染小鼠腹腔巨噬细胞48小时,CpG ODN(0.3μM剂量刺激)刺激6小时后,收集上清采用ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-6表达。结果显示,CLM3表达被干扰后,CpG ODN诱导的TNF-α和IL-6产生降低。将CLM3全长质粒转染RAW264.7细胞,操作步骤同上,结果显示,过表达CLM3后,CpG ODN诱导的TNF-α和IL-6产生增加。其它TLR配体如LPS刺激无明显变化。该结果证明CLM3参与并促进了TLR9触发的巨噬细胞的炎症反应过程。 CLM3促进了TLR9触发的巨噬细胞的炎症反应的信号转导机制如何?我们将MyD88、IRAK1、TRAF6、CLM3质粒与TNF-α报告基因共转染HEK293细胞,24小时后检测TNF-α报告基因活化情况。结果显示,CLM3过表达增强了MyD88、IRAK1、TRAF6诱导的TNF-α活化;同时,我们应用TRIF、TAK1、CLM3质粒与TNF-α报告基因共转染HEK293,24小时后检测TNF-α报告基因活化情况。结果显示,CLM3过表达对TRIF、TAK1诱导的TNF-α活化没有显著影响。提示CLM3能通过MyD88、IRAK1、TRAF6途径促进TLR9的信号转导。经免疫共沉淀实验结果证实,CLM3通过与MyD88结合来促进后者的信号转导,提示CLM3可能通过促进IRAK1和TRAF6或TRAF6和TAK1复合物的形成来促进TLR9的信号传递。我们又检测了MAPK及NF-κB的活化情况,将CLM3全长质粒转染RAW264.7细胞,24小时后以CpG ODN刺激,观察MAPK的磷酸化及NF-κB的p65亚基的入核情况。应用CpG ODN刺激过表达CLM3的巨噬细胞后,JNK、ERK的磷酸化增加,NF-κB的P65亚基较对照组入核增加,提示CLM3通过活化MAPK和NF-κB来调控细胞因子的产生。综上所述,我们克隆了属于CLM家族的CLM3分子并对其的生物学特性及功能进行了研究。CLM3主要在小鼠腹腔巨噬细胞中表达,能促进CpG ODN刺激的腹腔巨噬细胞炎性细胞因子的分泌,免疫共沉淀证实CLM3通过与MyD88结合来促进信号转导,且CLM3增强了CpG ODN诱导的MAPK、NF-κB的活化。本课题探讨了CLM3对TLR9通路的细胞因子产生的影响并初步研究了其作用机制,为免疫识别以及抗感染治疗提供了一条新的途径。下篇CMRF35样分子5(CLM5)促进TLR和RLH触发巨噬细胞分泌I型干扰素和炎性细胞因子及其相关分子机制研究在抗病毒免疫应答中,RLHs(RIG-I-like Helicase,RLHs)和TLRs是识别RNA病毒感染的两大主要受体家族。迄今为止,人源TLRs家族发现了11个成员,鼠源TLRs家族发现了13个成员,它们通过识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),而被活化,如TLR1, TLR2, TLR4, TLR6,和TLR10识别脂质,TLR3, TLR7, TLR8, TLR9识别病毒的RNA或DNA,因此,位于细胞内体的TLR3, TLR7, TLR8, TLR9被称为抗病毒的TLRs。受体活化胞内的级联信号通路后,诱导下游的TNF-α,IL-6,IL-1β等炎性因子的产生,且TLR3, TLR7, TLR8, TLR9能诱导抗病毒的I型干扰素产生。 RLHs是细胞质螺旋酶,包括RIG-I、Mda5和LGP2。与膜定位的TLRs不同,RLH位于细胞质并且识别产生于胞质内的RNA。RIG-I和Mda5含有一个DExD/H盒RNA螺旋酶结构域和两个CARD样结构域,LGP2缺乏CARD样结构域。虽然RIG-I和Mda5分别与不同的配体特异性结合,但它们都能诱导I型干扰素和炎症性细胞因子的转录。RIG-I主要识别ssRNA病毒,包括副粘病毒、流感病毒、VSV和日本脑炎病毒(JEV),而Mda5主要识别微小RNA病毒,如EMCV、脑心肌炎病毒和鼠脑脊髓炎病毒,另外Mda5参与识别polyI:C。LGP2根据RNA病毒类型的不同正向或负向调控RIG-I和Mda5应答。RLR信号通路通过活化NF-κB、MAPK和IRFs诱导I型干扰素的产生。为维持机体正常的抗病毒免疫,RLR信号通路也被许多分子调控,例如TRIM25通过促进RIG-I的泛素化正向调控抗病毒应答(13),RNF125能与RIG-I、Mda5和IPS-I结合并促进他们的泛素化,促进RIG-I降解(14)。此外,Atg12 Atg5结合物直接与RIG-I和IPS-I的CARD样结构域结合,抑制I型干扰素的诱导(15)。 CLM家族成员CLM5又名CD300d、DIgR1、MAIR-II、LMIR4。CLM5的跨膜区含有一个带负电荷的谷氨酸,胞内段很短且没有任何已知保守基序。RT-PCR证实CLM5主要表达在树突细胞、巨噬细胞和中性粒等髓系细胞中,但在淋巴系细胞中几乎没有表达。用Flag标记的CLM5转染RAW巨噬细胞后,抗FLAG抗体交联活化,引起受体下游P38、ERK1/2和JNK发生磷酸化,且交联活化的CLM5/RAW264.7细胞发生纤维化形态改变,由于CLM5能募集FcRγ,并且其它的FcRγ相关受体,如PIR-A和破骨细胞相关受体在抗体交联活化后也能增强破骨细胞的形成,因此提示CLM5可能也在破骨细胞的分化中发挥了作用。然而CLM5在细胞内的亚细胞定位情况如何?在炎性刺激时其细胞定位是否改变?其对巨噬细胞的细胞因子功能产生有何影响?是否参与了巨噬细胞的TLR和RLH的信号转导等等,这些问题尚未得到回答,也未见相关文献报道。通过GenBank数据库找到CLM5的全长mRNA序列(asscession No: AY457051),利用特异性引物,我们从小鼠腹腔巨噬细胞cDNA中克隆得到含666bp碱基的cDNA,预测其编码221氨基酸(a.a)的蛋白质,预计分子量为25kDa。对其氨基酸序列分析表明,该蛋白含有长17a.a的信号肽和23a.a的疏水跨膜区,胞外段含有特征性的IgV功能域(domain),属于Ig超家族成员,该受体胞内段很短,提示其可能对细胞功能起正向调控作用。通过搜索NCBI的基因组数据库,将CLM5定位于小鼠11号染色体的11E2区,染色体定位结果同CLM3,将CLM5蛋白序列在GenBank/EMBL数据库中作比较,发现与CLM5同源性较高的均为CLM家族成员,其中与CLM1同源性最高,胞外段IgV区域一致性为91%;与CLM家族蛋白质序列进行比对分析及进化树分析结果同CLM3。 RT-PCR分析表明,CLM5广泛分布于小鼠正常组织,在心、脑、肝、脾及淋巴结、胎盘、睾丸等组织均有不同程度表达,其中尤以肝脏、脾脏和淋巴结表达水平最高,在P815、Crip、RF、CT26、YAC-1、A20、3LL、Hepa、RAW264.7等细胞株中,CLM5在RAW264.7巨噬细胞中表达,在新鲜分离的小鼠原代的细胞中, CLM5在腹腔巨噬细胞和树突状细胞中表达,CLM5的这种在组织的广泛分布特点提示该分子在天然免疫防御中可能扮演了重要的角色。那么CLM5的生物学功能究竟如何?实验中我们发现,CLM5表达下调能抑制TLRs配体诱导的IL6和IFN-β的产生,CLM5 siRNA转染小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞48小时,以LPS(0.1μg/ml剂量刺激)、polyI:C(10μg/ml剂量刺激)、CpG ODN(0.3μM剂量刺激)刺激6小时后,收集上清采用ELISA试剂盒测定IL-6、IFN-β表达,结果显示,CLM5表达被干扰抑制后,LPS、polyI:C、CpG ODN诱导的IL-6、IFN-β产生显著降低,提示CLM5参与了TLRs触发的巨噬细胞天然免疫应答过程及其信号转导的调控。以MOI 10的VSV感染干扰CLM5后的巨噬细胞,IFN-β产生显著降低,对CLM5的功能进行检测,发现干扰CLM5后其TCID50显著增高,提示CLM5参与了RLH触发的信号转导调控。我们进一步探讨CLM5对TLRs触发的IFN-β产生影响的作用机制,实验发现,CLM5促进TRIF、MDA5、RIG-I介导的IFNβ转录增强。将TRIF(或MDA5、RIG-I)、pCMV-CLM5质粒与IFN-β报告基因共转染HEK293细胞,24小时后检测IFN-β报告基因活化情况,结果显示,CLM5过表达增强了TRIF、MDA5、RIG-I诱导的IFN-β转录增强,并且,从结果中我们可以看出,单独转染CLM5与IFN-β报告基因,CLM5随转染剂量的增加,能呈递增趋势诱导IFN-β活化,提示CLM5能通过TRIF、MDA5、RIG-I途径促进IFN-β活化,其本身也可以通过以上三条途径以外的其它机制促进IFN-β活化。本实验提示,CLM5参与了RLH和TLRs的信号调控。免疫共沉淀证实,CLM5可以与含有ITAM基序的FcRγ相结合,FcRγ可能在CLM5对RLH和TLR信号转导的调控中发挥一定功能。综上所述,我们对CLM家族的CLM5的生物学特性及功能进行了研究,发现CLM5主要在小鼠腹腔巨噬细胞中表达,干扰CLM5表达之后能够降低TLRs配体刺激的腹腔巨噬细胞IFN-βand IL6的分泌,经VSV刺激后IFN-β产生也降低。进一步研究表明CLM5能增强TRIF、MDA5、RIG-I介导的IFNβ转录增加,可见CLM5可以促进TLR和RLH触发的巨噬细胞的天然免疫应答及其信号转导。
【图文】：

流程图,真核表达载体,天然免疫,流程图

pcDNA3.1/CLM3-Flag真核表达载体克隆流程图

流程图,流程图,免疫沉淀物,组织蛋白

图 1-2.pGEX-CLM3 原核表达载体克隆流程图re 2. Illustration for the construction of pGEX-CLM3 expression vectoern印迹检测养细胞，在含 1mM PMSF 的 PBS 中洗两次，重悬于 T-PER 组织蛋白E）中，混匀，，置冰上 20 分钟，以 10,000g 4°C 离心 10 分钟，收集上采用 BCA 法。样品或免疫沉淀物行SDS-PAGE，随后以100V恒电压于4°C 转至硝酸红染色并标记大小和方向。室温封闭2小时（含5％脱脂奶粉的TBST稀释液，室温孵育1小时。TBST（含0.05％ Tween 20的TBS溶液）洗
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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