鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药机制研究

发布时间：2019-08-15 12:19

【摘要】： 【目的】测定临床分离鲍曼不动杆菌的喹诺酮耐药表型,探讨其基因之间的同源性;研究其耐药表型与其染色体上gyrA和parC基因突变的关系;研究临床分离鲍曼不动杆菌的外排泵基因的表达情况。【方法】 (1)采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星和加替沙星对90株临床分离鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度;采用基因外回文序列进行同源性分析。 (2)聚合酶链式反应扩增鲍曼不动杆菌的gyrA和parC基因,对PCR产物进行变性高效液相色谱(DHPLC)分析及DNA测序。 (3)琼脂稀释法测定外排泵抑制剂(CCCP)对喹诺酮药物对鲍曼不动杆菌的抗菌活性的影响。RT-PCR扩增鲍曼不动杆菌外排蛋白基因(adeB),利用图像分析软件(Bandscan)测定其相对灰度值,分析耐药株和敏感株在表达adeB基因方面的差异。【结果】 (1) 90株鲍曼不动杆菌中,对左氧氟沙星和加替沙星耐药率分别为63.3%和60.0%。同源性分析可分成9种基因型。其中A型3株(3.33%)、B型40株(44.44%)、C型22株(24.44%)、D型5株(5.56%)、E型7株(7.78%)、F型2株(2.22%)、G型2株(2.22%)、H型7株(7.78%)、I型2株(2.22%)。其中以B型数目在各型中数目是最多的。 (2) 90株均扩增出了343 bp的gyrA基因和327bp的parC基因产物。9种基因型中,3种表型耐药的基因型PCR产物经DHPLC检测均出现异常双峰或者多峰。测序证实gyrA基因存在83位Ser→Leu突变,parC基因存在80位Ser→Leu突变,同时parC基因还存在3个位点的同义突变;敏感株运用DHPLC检测只出现单峰,测序未发现突变。 (3)使用CCCP后,有71株MIC值出现不同程度的下降,其中16株出现泵表型阳性(耐药株14株,敏感株2株)。90株逆转录成cDNA后,有84株表达adeB基因。耐药株中有96.7%(63/65)表达adeB基因,敏感株中有84.0%(21/25)表达adeB基因。【结论】 (1)目前细菌对四代喹诺酮类药物的耐药情况已经开始接近三代喹诺酮类药物,值得临床密切关注。 (2)2007年12月至2008年4月之间我院可能存在某一基因型鲍曼不动杆菌的感染流行。 (3)DHPLC在检测耐药基因突变方面具有高灵敏,经济快捷等优点,具有广泛的应用前景。 (4)鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药与gyrA和parC基因的高频突变密切相关。parC基因的3个位点的同义突变提示parC基因更易于发生突变。 (5)外排泵抑制剂可以增强喹诺酮药物的抗菌活性,药物的主动外排现象已经普遍存在于临床分离的鲍曼不动杆菌之中。 (6)主动外排作用是鲍曼不动杆菌产生耐药的一个重要机制,其中adeB基因表达增强在细菌对喹诺酮类药物耐药方面起着重要作用。
【图文】：

图谱,耐药株,表型

gyrA基因的DHPLC图谱

图谱,亮氨酸,丝氨酸,氨基酸

19注： A、B、C为表型耐药株，， D为敏感株图4 parC基因的DHPLC图谱3 株标本 gyrA 基因的测序结果发现存在相同的突变位点，而存在相同的突变位点。其中 gyrA 基因 83 位氨基酸 TCA 中的氨基酸由丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)；parC 基因 80 位碱基中的 C→T，导致丝氨酸(Ser)→亮氨酸(Leu)，另外 A、B、rC基因测序还存在3个位点的同义突变(71G→T,75T→C,81T
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378.99

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