基于荧光素酶活性检测的小鼠攻毒模型以及新型阳离子载体促进DNA疫苗黏膜初免效果研究

发布时间：2019-08-28 07:31

【摘要】： 据世界卫生组织统计,2007年全年新发人类免疫缺陷病毒1型(HumanImmunodeficiency Virus Type 1,HIV-1)感染人数为270万,200万例死亡与HIV-1相关,全球估计仍有3千多万HIV-1感染者。有效的HIV-1疫苗是控制传染病蔓延的最佳手段。然而,尽管HIV-1疫苗研发超过20年,研制有效的疫苗控制HIV-1感染仍然面临许多挑战。挑战之一就是缺乏合适的动物模型用于临床前筛选候选疫苗。由于HIV-1只能感染猪尾猴和黑猩猩等动物,这类动物数量较少,而且感染后难以出现艾滋病,已不适宜HIV-1相关的实验应用。当前大多数HIV-1临床前疫苗有效性评价是在嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(Chimeric Simian/Human Immunodeficency Virus,SHIV)/恒河猴模型上进行的,而这类模型成本高,必须在大动物P3实验室进行,因而无法在普通研究机构进行,难以满足检测当前广泛的疫苗以及疫苗策略筛选的需要。而小动物由于宿主自身限制无法被HIV-1感染,难以直接建立疫苗保护性评价模型。而多年来利用重建人类免疫系统等方式改造小鼠等宿主,已经较为成功地在小动物上建立了HIV-1感染模型。在此基础上,还成功地运用于评价中和抗体以及抗病毒药物的疗效,但因为方法自身的限制,在此类模型上尚不能活化产生长期的获得性免疫,所以无法用于疫苗保护性评价。在本研究的第一部分中,为了构建可用于疫苗保护性评价的小鼠模型,我们以复制型痘苗病毒天坛株为载体,构建了表达萤火虫荧光素酶与HIV-1 Gag融合蛋白的重组痘苗病毒rTTV-lucgag。我们利用荧光素酶活性替代病毒滴定,首先通过在腹腔接种该重组痘苗病毒后分析其在小鼠体内的动态分布。结果表明,该重组痘苗病毒在小鼠卵巢、子宫、宫颈等部位有较高的复制能力,在攻毒后第2天达到峰值(卵巢,242 273±131 222Relative Luciferase Unit(RLU)/毫克蛋白;子宫,192 613±328 398 RLU/毫克蛋白;宫颈,78 182±135 049 RLU/毫克蛋白),攻毒后第5天在卵巢部位还能检测到病毒分布(66 621±83 630 RLU/毫克蛋白),病毒在其他组织复制能力相对较弱。以上结果说明卵巢是最佳的评价位点,可用于评价Gag疫苗保护效果,而且卵巢部位荧光素酶活性分别与病毒滴度(r~2=0.7143,p＜0.0001)和Gag表达(r~2=0.5699,p=0.03)显著相关。随后,我们以表达HIV-1 Gag免疫原的质粒DNA为疫苗免疫小鼠,通过对比疫苗免疫小鼠与对照小鼠在攻毒后卵巢组织病毒复制能力的差异,验证我们的攻毒模型可靠性。攻毒后第3天,HIV-1 Gag DNA疫苗免疫组的小鼠卵巢荧光素酶活性为1 538±462.5 RLU/毫克蛋白,约为对照组(6 006±3 141 RLU/毫克蛋白)的四分之一,该结果表明疫苗免疫后小鼠清除病毒能力强于对照组小鼠。这些数据表明该重组病毒显示出较好的潜力,能用于评价HIV-1 Gag DNA疫苗的保护效果。因此,我们认为荧光素酶活性在体内能代表痘苗病毒复制,可以代替病毒滴定用于监测病毒体内复制,而且这种rTTV-lucgag/小鼠模型能用于HIV-1 Gag疫苗由杀伤性T细胞介导的保护效果评价。 HIV-1疫苗研发的另一个挑战是开发安全有效的疫苗载体。病毒载体具有感染性和复制能力,是当前用于基因投递最有效的载体,但安全性、载体反应、插入片段大小限制以及病毒嗜性等因素限制了其在体内基因治疗和疫苗研究中的应用。DNA疫苗本身不具有免疫原性,可以进行多次重复免疫,但其体内转染效率低下,限制了其诱发免疫应答的能力。因而,基因治疗和疫苗开发还需要安全有效的DNA疫苗投递载体。阳离子聚合物聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(Poly[2-(N,N-dimethylamino)Ethyl Methacrylate],PDMAEMA),和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)一样,能通过静电作用与负电性的DNA结合,从而提高其体外转染效率,但高细胞毒性限制了其在体内的应用。在本研究第二部分,我们通过聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)化改造了高细胞毒性的阳离子聚合物PDMAEMA。凝胶延迟实验、粒径测试以及电镜结果均表明,PEG化改造后的PDMAEMA仍保留包裹DNA的能力,能与DNA形成直径为150nm左右的复合物颗粒。随后我们将复合物与293T细胞共孵育,以检测其细胞毒性以及转染效率。数据表明,在N/P为30及以上时,PEG改造后显著降低了PDMAEMA的细胞毒性,在一定范围内,细胞毒性下降幅度随N/P增加而增大,同时我们以绿色荧光蛋白为报告基因,研究了PEG改造对细胞转染效率的影响,发现PEG化后的PDMAEMA体外转染效率也有较大程度降低,其转染效率不到PEI的二十分之一。我们以表达HIV-1 Gag免疫原的质粒DNA黏膜初免,痘苗病毒载体系统加强为模型,评价了PEG化的PDMAEMA对DNA疫苗鼻内黏膜初免效果,结果表明,PEG化的PDMAEMA能引起活跃的Gag特异性T细胞免疫应答(163±35 Specific Spot Forming Cells(SFCs)/1×10~6脾细胞),显著高于单独DNA疫苗效果(56±5 SFCs/1×10~6脾细胞,p=0.0052),而且显著高于PEI组(99±14 SFCs/1×10~6脾细胞,p=0.0441)。PEG化的PDMAEMA引起血清抗体水平也显著高于单独DNA疫苗组(p=0.0341)。我们随后还在体外证明了PEG化的PDMAEMA具有免疫佐剂活性,能有效刺激小鼠巨噬细胞肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)、白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)等炎症因子应答,从而表明其可具备能增进疫苗效果的佐剂作用。总之,PEG改造后的PDMAEMA能显著降低细胞毒性,还能有效提高DNA疫苗的黏膜初免效果。以上结果表明,对于阳离子聚合物载体,由于存在潜在的佐剂效应,体外转染效率并不能决定其体内疫苗免疫效果。
【图文】：

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体外转染,细胞毒性,转染,存活率

为了考察PEG化对于细胞转染效率的影响，，我们用表达绿色荧光蛋白的质粒PSv一EGFP分别与PEG一PDMAEMA和PDMAEMA复合，孵育充分后对293T细胞进行转染，48小时后处理细胞进行流式检测(图2一sc)，结果如图2一5b所示。对比两组数据我们可以看出，PEG化对于体外转染效率的影响明显。均聚物PDMAEMA的最高转染效率约为10%，而PEG化后最高转染效率仅为1%。这可能是由于PEG化后复合粒子的表面电势大大降低，导致其与表面带负电荷的细胞结合能力下降，同时和PDMAEMA段结合的DNA从复合体上解离也更加困难【65，66]。另外，两种聚合物形成的复合物的转染效率均与N用比值相关。PEG一PDMAEM刀DNA复合物的最高转染效率出现在N/P=45。 2.3.4PEG一PDMAEMA促进DNA疫苗薪膜初免效果为测试PEG一PDMAEMA用作DNA疫苗载体赫膜初免效果，同时考虑到不同N/P比对体外转染效率和细胞毒性的影响
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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