葡萄球菌分离株肠毒素基因型分析及两种毒素的表达纯化

发布时间：2019-09-05 08:21

【摘要】： 葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是由葡萄球菌产生的一类外毒素,是引起人类食源性疾病的重要致病因子。葡萄球菌肠毒素基因可通过噬菌体转导,整合子、转座子、质粒等分子元件的转移导致新型肠毒素的不断产生,了解新型肠毒素蛋白的结构与功能,建立相应的检测评价方法具有重要意义。 本研究通过生物信息学分析,设计了不同葡萄球菌肠毒素基因(sea,see,seb,sec,ced,tsst,seg,seh,sei,selj,selk,sell,selm,seln,selo,selq,selu)的PCR检测引物,通过葡萄球菌DNA提取、PCR条件优化等,建立了16种不同肠毒素基因型特异性检测的PCR方法。 应用建立的基因分型检测方法,对分离自生鲜牛奶、奶酪、土壤,人、猪、牛、羊、鸡等动物性产品或动物体表、环境中122株葡萄球菌分离株肠毒素基因型的检测,初步了解了葡萄球菌国内分离株肠毒素基因的分布情况,结果表明:(1)除selj型阴性外,其它16种基因型均有检出,95.9%的葡萄球菌含有至少一种SE基因,110株含有一种以上SE基因(90.2%),其中47.5%的菌株携带至少5种以上的肠毒素基因型,表明肠毒素基因簇(egc)广泛存在于葡萄球菌国内分离株。肠毒素型检出率最高的三种肠毒素基因为tsst,sei和seb,分别为62.3%, 54.1%和46.7%,未检出selj型肠毒素。(2)除金黄色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、中间葡萄球菌、表皮葡萄球菌等已报道的葡萄球菌外,我们分离的非致病性葡萄球菌菌株(猪葡萄球菌、华纳氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、克氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌、耳葡萄球菌)也检测到多种葡萄球菌肠毒素基因。动物非致病性葡萄球菌分离株可携带多种肠毒素基因,为食品安全带来新挑战。(3)葡萄球菌菌株的致病性与其种类、携带肠毒素的种类、分离来源密切有关。分离自病样,感染能力较强的菌株,产生的肠毒素种类和数量都多;猪源和鸡源的葡萄球菌携带除了selj以外的16种肠毒素基因型,兔源和人源携带了除selj和sec以外的15种。 通过设计sea、selo肠毒素基因表达引物,从含有肠毒素基因簇的葡萄球菌ZNZ2-3分离株成功克隆了两种葡萄球菌肠毒素sea和selo基因,sea基因与GenBank已报道序列完全一致, selo发生点突变,但该突变为同义突变。应用克隆基因构建了两种肠毒素的融合表达载体pEGX-6P-SEA和pEGX-6P-SEO,转化大肠杆菌BL21宿主菌,经诱导后获得了重组融合蛋白,重组蛋白分别占菌体蛋白的26%和22%。经亲和层析纯化获得重组肠毒素蛋白,Western-Blot检测表明,表达的重组蛋白能够被SEA和SEO阳性血清识别,具有良好的抗原性。
【图文】：

毒素检测 PCR 反应程序：min；94℃变性 30s，按照各型 Tm（表 2；94℃变性 30s，51℃退火 40s，，72℃延4℃保温 6min。CR 产物进行 1%的琼脂糖凝胶电泳， 1行结果分析。析菌分子生物学方法鉴定es 报道的方法对疑似葡萄球菌进行 PCRM 1 2 3 4 5 6

章 葡萄球菌肠毒素基因检测 PCR 技术的菌，说明该方法对各个种属的葡萄球法的确定采取了碱裂解法，在提取过程中分别入少量溶菌酶后，DNA 的丰度明显效果不明显，实验最终确定在碱裂解提取方法 PCR 结果见图 2-3。M 1 2 3 4 5
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R378

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 李毅;金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展[J];中国卫生检验杂志;2004年04期

本文编号：2532087