支原体污染的巢式PCR检测法的摸索及其初步验证

发布时间：2019-09-05 15:31

【摘要】： 支原体是细胞污染物中常见的一种,污染细胞的支原体主要有5种:牛源的精氨酸支原体和莱氏支原体、猪源的猪鼻支原体、人源的口腔支原体和发酵支原体,这5种支原体占所有支原体污染的95%以上。与传统的支原体检测方法相比,PCR方法具有操作简便易行、检测周期短和灵敏度高等优点,所以近年来该方法得到了发展,但该方法目前存在的问题是无法同时扩增出上述5种支原体、与进化上相近的种易产生交叉扩增或无法直接通过PCR结果推断污染类型。鉴于此,本实验旨在建立支原体污染的巢式PCR检测法,PCR扩增后根据目的片段的有无判断样品是否被支原体污染,根据PCR产物的大小初步判断所污染支原体的类型,并通过对第二轮PCR产物测序,进一步证实所污染支原体类型,从而推断污染源。 本实验以16S-23S rDNA的间隔序列(ISR)为靶序列,对5种支原体的ISR进行了种内及种间生物信息学比对分析,据分析结果自行设计两套巢式PCR引物,以期同时有效检测5种支原体污染。以精氨酸支原体、猪鼻支原体、口腔支原体和莱氏支原体的基因组DNA(未购买到发酵支原体)为模板,巢式PCR扩增后分别对两轮PCR产物进行测序,电泳结果和测序结果表明PCR产物的片段长度和碱基组成与预期结果一致。实验自行构建了含口腔支原体16S-23S rDNA间隔序列的质粒,设为阳性对照。方法学验证:实验考察了检测限(LOD50)、特异性和耐受性三个参数,并评估了交叉污染的情况。检测限:精氨酸支原体、猪鼻支原体、口腔支原体和莱氏支原体的LOD50分别为1.5、1.0、0.6和2.7gc/reaction。特异性:以梭菌属、乳杆菌属和链球菌属(进化上与支原体相近)以及另外12种细菌(生产上常见的细菌污染类型)和Vero细胞DNA为对象,考察引物的特异性,结果表明均未产生交叉扩增。耐受性:考察了不同的操作者、不同的PCR仪、样品存储条件及高浓度Vero细胞基因组DNA、细胞内容物对PCR扩增的影响,结果表明仅样品存储条件对检测结果有影响。交叉污染:将强阳性样本与阴性样本同时进行巢式PCR扩增,电泳结果表明未出现假阳性,说明条件控制得好就可以避免假阳性的产生。初步应用:同时用巢式PCR法和指示细胞法检测了13个样本,对两种方法检测结果不一致的样品再用直接培养法进行检测,结果表明巢式PCR法检测结果可信。 本实验建立了支原体污染的巢式PCR检测法并对该方法进行了初步验证,该方法灵敏度高,特异性好,耐受性强,为支原体的检测提供了技术参考。由于该方法可以4小时内出结果,因此可对生产进行过程控制,当天获得结果使得多个取样点的在线监测成为可能,这有利于我们及时根据结果决定下一步操作,防止污染蔓延。
【图文】：

表 3. 引物名称和序列Table 3. Primer name and nucleotide sequences注：引物 F2参考文献[11]引物名称 引物序列Pf1 CCTTTCTAAGGAGAAAGGCTAACTAPr1 GTCCTCCTATCTTCAAACGGGATTCPf2 AGAAAGGCTAACTAACACTTAGCACPr2 GTGCCAAGGCATCCACTGTGTF1 CGTCACACCATGGGAGCTGGTAATR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA

注：引物 F2参考文献[11]图 1a. 莱氏支原体引物在 rDNA 操纵子上的位置Figure 1a. Primers positions of A.laidlawii at the rDNA operonR1 CTTCATCGACTTTCAGACCCAF2 GTTCTTTGAAAACTGAATR2 AGACCCAAGGCATCCACCAA
【学位授予单位】：武汉生物制品研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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