针对HER-3的RNA干扰真核表达载体的构建和功能研究
发布时间:2019-09-11 10:34
【摘要】: 目的:设计和构建针对HER3基因mRNA的特异性RNA干扰质粒载体并转染人乳腺癌MDA-MB-453细胞株,研究此细胞株中HER3的RNA干扰抑制效率,以及HER3表达下调对细胞株生长增殖的影响,初步探讨RNA干扰技术防治乳腺癌的可行性。 方法:设计两个shRNA序列,构建了两组针对HER3基因mRNA的可以稳定遗传的特异性RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-TetP-HER3的重组质粒(简称:RNAi-HER3质粒)。转染人乳腺癌MDA-MB-453细胞株,进行体外研究。用RT-PCR、Western Blotting和流式细胞术分别在mRNA水平和蛋白质水平检测重组质粒对乳腺癌MDA-MB-453细胞株HER3基因表达的抑制作用,MTT法检测细胞存活率,并观察转染重组质粒对细胞生长的影响。 结果:(1). DNA测序结果显示,构建的2个重组质粒(依据设计shRNA序列的位点命名为RNAi-HER3-131、RNAi-HER3-326)符合试验设计要求。(2). RT-PCR技术检测,RNAi-HER3-131转染24小时后HER3mRNA表达量明显低于对照组,有明显的干扰作用;而RNAi-HER3-326转染24小时后HER3mRNA表达量与对照组相比无明显变化,提示RNAi-HER3-326干扰作用不明显。(3). Western Blotting技术及流式细胞术检测,RNAi-HER3-131转染MDA-MB-453细胞24小时后HER3的蛋白表达明显受抑;RNAi-HER3-326转染细胞与对照组相比蛋白表达无明显变化。(4). MTT法检测细胞的存活率,RNAi-HER3-131转染24小时后存活率显著低于对照组和RNAi-HER3-326转染组(P0.01),而空载体转染组和RNAi-HER3-326转染组与对照组比,存活率无明显统计学差异(P0.05)。 结论:转染及RNA干扰技术建立的HER3表达抑制细胞可以成为简单实用的细胞模型;HER3-siRNA抑制HER3的表达后可在体外抑制MDA-MB-453细胞的存活。
【图文】:
同济医学院 倒置显微镜(日本 Nikon)垂直 SDS-PAGE 电泳系统(美国 BIORAD)全自动 X 光片洗相系统(美国 KODAK)FACalibration(美国 BD 公司)iRNA 真核表达载体的构建
EcoRI 酶切黏末端的正、反寡核苷酸链,,然后退火成双链DNA,插入RNAi表达载体,转化DH5α大肠杆菌,经氨苄青霉素筛选得到阳性克隆,用通用引物U6对之进行测序。结果如图2a和图3a所示,在有效测定区,其测量峰明显,杂峰很小,表明其准确度较高。比对结果提示克隆的HER3-RNAi-131和HER3-RNAi-326的序列准确无误(图2b,图3b)。图 2a HER3-RNAi-131 测序图
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R346
本文编号:2534366
【图文】:
同济医学院 倒置显微镜(日本 Nikon)垂直 SDS-PAGE 电泳系统(美国 BIORAD)全自动 X 光片洗相系统(美国 KODAK)FACalibration(美国 BD 公司)iRNA 真核表达载体的构建
EcoRI 酶切黏末端的正、反寡核苷酸链,,然后退火成双链DNA,插入RNAi表达载体,转化DH5α大肠杆菌,经氨苄青霉素筛选得到阳性克隆,用通用引物U6对之进行测序。结果如图2a和图3a所示,在有效测定区,其测量峰明显,杂峰很小,表明其准确度较高。比对结果提示克隆的HER3-RNAi-131和HER3-RNAi-326的序列准确无误(图2b,图3b)。图 2a HER3-RNAi-131 测序图
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R346
【参考文献】
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1 胡伟国;Her-2的研究进展与乳腺癌[J];肿瘤学杂志;2002年06期
本文编号:2534366
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