弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究

发布时间：2019-09-21 08:56

【摘要】： 目的:(1)探讨弓形虫速殖子体外培养、冻存和纯化的方法,为后续开展弓形虫的相关研究提供丰富而纯化的速殖子。(2)比较5种常用弓形虫速殖子DNA提取方法,为后续实验弓形虫速殖子DNA提取筛选高效简便的方法。(3)建立和优化LAMP反应体系,为弓形虫病的诊断建立一种灵敏度高、特异性强、简单快速的弓形虫DNA检测方法。 方法:(1)将弓形虫速殖子接种至Hela细胞,动态观察速殖子在Hela细胞中增殖的体外培养过程。(2)速殖子中加入7%二甲亚砜和15%的乙二醇于-76℃冻存,观察6个月内两种防冻剂对速殖子的冻存保护效果。(3)比较3、5、8μm3种规格的滤膜对体内外培养的速殖子的纯化效果。(4)分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA,通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果。(5)采用环介导等温扩增技术建立了检测弓形虫DNA的方法,并对反应体系进行了优化,在此基础上进行特异性、敏感性评估,并与传统PCR进行了比较。 结果:(1)弓形虫速殖子能在Hela细胞中较好的生长增殖,并且在96～144h增殖达到高峰,这个时间段收集速殖子产量较高,Hela细胞基本被破坏,含Hela细胞较少。(2)用7%二甲亚砜和15%的乙二醇-76℃冻存速殖子,第1个月末两者防冻效果没有明显差异(P 0.05),第3个月末和第6个月末7%二甲亚砜的防冻效果优于15%的乙二醇(P0.05)。随着时间的推移速殖子的存活率下降,但在6个月末两种方法冻存的速殖子都能成功感染小鼠。(3)在体内培养的速殖子纯化时,3、5、8μm3种规格的滤膜对白细胞的清除率无差别(P 0.05);对红细胞的清除率随滤膜孔径的增加而降低,三者之间具有显著差异(P0.05);速殖子的回收率随孔径的增加而增加,三者间具有显著差异(P0.05)。在体外培养的速殖子纯化时,3、5、8μm3种规格的滤膜对Hela细胞的清除率无差别(P 0.05),速殖子的回收率随孔径的增加而增加,三者间具有显著差异(P0.05)。(4)酚-氯仿法提取的DNA纯度最高,煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低;琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚-氯仿法、盐析法提取1×106个速殖子的基因组DNA;试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检测最少速殖子的数量依次为1×104 ,无目的条带,1×102,1×101,1×103个。(5)通过对建立的LAMP扩增弓形虫DNA反应体系的优化,发现25μl体系以1.2 mM dNTPs,6mM MgSO4,8U Bst DNA聚合酶为佳,反应温度在63℃为佳,反应时间可根据需要选择30～60min之间,用琼脂糖凝胶电泳检测未能发现加入环引物能加快反应温度。甜菜碱对反应影响不大。特异性评估表明仅弓形虫检测阳性。LAMP的灵敏度比常规PCR高10倍,即每毫升可检测到个位数的速殖子数。在检测弓形虫感染小鼠组织标本时,两者特异性无差别。除琼脂糖凝胶电泳检测反应结果外,还可以通过比浊仪,离心后肉眼观察沉淀及加入荧光染料后在紫外灯下观察LAMP结果。 结论:Hela细胞可用于弓形虫速殖子的体外培养增殖,速殖子在加入防冻剂的情况下可在-76℃冰箱保存半年以上,可以根据后续实验选择不同孔径的滤膜用于弓形虫速殖子的纯化。经典的酚-氯仿法体取速殖子DNA纯度高,但操作比较繁琐,直接煮沸法操作方便,能满足一般实验对DNA的提取要求。本研究建立的LAMP检测弓形虫基因组DNA方法,特异性强、敏感性高、简便快速且成本低,通过不断的改进,有望成为一种新的诊断弓形虫的方法。
【图文】：

10图 1-1 速殖子侵入 Hela 细胞动态观察 （×400）A:正常 Hela 细胞 B：速殖子侵入 Hela 细胞 4hC:速殖子侵入 Hela 细胞 24h D:速殖子侵入 Hela 细胞 48hE:速殖子侵入 Hela 细胞 96h F:速殖子侵入 Hela 细胞 144hFig.1-1 Continual observation of tachyzoites infecting Hela cell（×400）A:Normal Hela cell B: Hela cell infected with tachyzoites after 4hC: Hela cell infected with tachyzoites after 24h

D: Hela cell infected with tachyzoites after 48hE: Hela cell infected with tachyzoites after 96hF: Hela cell infected with tachyzoites after 144h2.2 小鼠腹水中弓形虫速殖子的形态观察腹水中速殖子经瑞氏（图 1-2A）和瑞氏-吉姆萨(图 1-2B)染色，可见虫体在腹水中分散存在或排列成菊花状，被速殖子侵入的细胞，胞浆破裂，速殖子围绕于核周。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R382.5

【引证文献】

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1 刘明如;弓形虫单克隆抗体的制备及生物学活性的初步鉴定[D];广西大学;2012年

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本文编号：2539270