Tiam1在着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞中的表达及其抗体对胚泡粘附的影响

发布时间：2019-09-22 07:25

【摘要】： 背景: Tiam1(T-lymphoma invasion and metastasis inducing protein 1,T淋巴细胞侵袭转移诱导蛋白1)是一种鸟嘌呤核苷酸转换因子,其编码蛋白质与GDP分化刺激因子(GDS)的Dbl(DH)区域具有较高同源性。该基因的过表达可激活Rho样GTP酶Racl,而活性的Rac1在细胞骨架重组、细胞粘附与运动、基因表达调控、细胞凋亡、神经细胞轴突与树突的形成及细胞周期调控等过程中发挥着重要。Tiam1蛋白可调节粘附分子介导的细胞粘附,参与粘附复合物的组装,诱导肿瘤的侵袭,并且介导蛋白复合物的形成及膜定位,参与蛋白质间的相互作用[1,2]。胚胎植入是一个复杂的过程,涉及到母体子宫与胚胎之间多因素的精细调控,包括胚胎的定位、附着及侵入子宫内膜、细胞外基质的广泛性降解和重塑、滋养层细胞介导下侵入到母体子宫内膜细胞中和母体子宫内膜细胞分泌等[3,4,5]。对于胚胎着床来说,胚胎发育和子宫内膜修饰之间的同步化是至关重要的[3,6]。最近几年,Tiam1在肿瘤发生中参与了肿瘤细胞迁移、粘附和侵袭及细胞外基质的降解等过程中的作用已被提出并大量研究,由于胚胎植入与肿瘤侵袭过程很大程度上具有相似性[7],Tiam1是否在胚胎植入过程中起一定作用,对其进行研究将具有很重要的意义。前期的研究表明:①Tiam1在动情期小鼠子宫内膜高表达;②在早孕小鼠的子宫内膜中,Tiam1在基质细胞中强表达,且随着妊娠天数的增加呈现逐渐增强的趋势,在妊娠第五天达到最高值[8]。推测Tiam1可能通过调节粘附分子介导的细胞粘附作用促使胚泡的移动、定位和粘附,并可能在胚泡植入的侵袭期间n 入了滋养层的侵袭及细胞外基质的降解等过程有关。目的:通过检测Tiam1在着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞中的表达情况,探讨在体外试验中封闭Tiam1功能后对胚泡粘附的影响。方法: 1、采用胰蛋白酶消化与机械振荡相结合法提取着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞,采用免疫细胞化学法鉴定基质细胞及其细胞纯度并对其生长状况进行显微观察。 (1)运用RT-PCR检测Tiam1mRNA在着床窗口期和未孕小鼠子宫内膜基质细胞的表达。 (2)运用免疫细胞化学法检测Tiam1蛋白在着床窗口期和未孕小鼠子宫内膜基质细胞的表达。 2、建立体外着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞、胚泡共培养体系,用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液将抗Tiam1抗体分别稀释成0mg/L、100mg/L、200mg/L和400mg/L的浓度梯度。采用不同的抗体浓度干扰共培养体系,运用免疫细胞化学和western blot检测Tiam1蛋白的表达,并计数不同浓度下胚泡的粘附数。 (1)采用免疫细胞化学法检测抗Tiam1抗体不同浓度下着床窗口期和未加抗Tiam1抗体下小鼠基质细胞中Tiam1蛋白的表达情况。 (2)采用Western blot法检测抗Tiam1抗体不同浓度下着床窗口期和未加抗Tiam1抗体下小鼠基质细胞中Tiam1蛋白的表达情况。结果: 1、经过免疫细胞化学法鉴定后,获得着床窗口期基质细胞纯度为93.8±0.5%,显微观察发现,基质细胞接种24h后大部分细胞已贴壁,培养3d后细胞排列紧密、形态为长梭形。 (1) RT-PCR: Tiam1mRNA在着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞中较强表达,而在未孕小鼠子宫内膜基质细胞中弱表达。 (2)免疫细胞化学: Tiam1蛋白在着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞中表达较强。在未孕小鼠子宫内膜基质细胞中,Tiam1蛋白表达较弱。 2、不同的抗体浓度干扰共培养体系中,在抗体浓度分别为0 mg/L、100mg/L、200mg/L和400mg/L时,胚泡的粘附率分别为34.41%、24.00%、20.62%和13.82%,抗体处理组和对照组之间有明显的差异性(p0.05)。免疫细胞化学和Western blot检测结果表明,随着抗Tiam1抗体浓度的增加,Tiam1蛋白的表达量逐渐下降,同时胚泡的粘附率也逐渐降低。结论: Tiam1在着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞中强表达。在体外着床窗口期小鼠子宫内膜基质细胞、胚泡共培养体系中,加入抗Tiam1抗体于共培养体系后发现,随着抗Tiam1抗体浓度的增加胚泡的粘附率呈现降低的趋势。以上研究结果表明Tiam1可能在胚泡植入过程中参与了胚泡的定位、粘附及侵袭等生理作用。
【图文】：

子宫内膜基质,细胞

化学随机选择 5 个高倍视野观察细胞有无棕黄染色。1.2.5 统计学处理所有数据均以 X±s 表示，采用 SPSS13.0 统计学软件进行分析。2 结果2.1 子宫内膜基质细胞生长状况显微观察倒置显微镜下观察发现，酶消化后的子宫内膜明显变薄，变得疏松，消化液变得浑浊，所获得的细胞大部分呈单个分散的圆形，细胞有少量细胞团。基质细胞于接种 0.5h 后开始贴壁，接种 24h 后大部分细胞已贴壁，细胞呈短梭形或多角形（见图 1）。培养 2d 后细胞生长旺盛，大部分为长梭形，几乎无多边形细胞，基本上铺满培养板（见图 2），可以连续培养 5d，不可以传代。

子宫内膜基质细胞,细胞

化学随机选择 5 个高倍视野观察细胞有无棕黄染色。1.2.5 统计学处理所有数据均以 X±s 表示，采用 SPSS13.0 统计学软件进行分析。2 结果2.1 子宫内膜基质细胞生长状况显微观察倒置显微镜下观察发现，酶消化后的子宫内膜明显变薄，变得疏松，消化液变得浑浊，所获得的细胞大部分呈单个分散的圆形，细胞有少量细胞团。基质细胞于接种 0.5h 后开始贴壁，接种 24h 后大部分细胞已贴壁，细胞呈短梭形或多角形（见图 1）。培养 2d 后细胞生长旺盛，，大部分为长梭形，几乎无多边形细胞，基本上铺满培养板（见图 2），可以连续培养 5d，不可以传代。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R321

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