抑制Ppif基因的表达减轻肾缺血再灌注损伤的实验研究

发布时间：2019-09-24 00:09

【摘要】：目的：建立稳定的体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注模型,寻找建立模型的最佳条件,并验证大鼠Ppif基因在缺血再灌注模型中的表达；研究siRNA对大鼠Ppif基因的抑制作用；构建pGCL-Ppif即介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装pGCL-Ppif慢病毒载体奠定基础；观察抑制大鼠Ppif基因的表达对缺血再灌注损伤肾脏的保护作用,并探讨其作用机制。 方法：(1)体外培养正常大鼠肾细胞(NRK cells),以氧糖剥夺(krebs)液及使用去氧剂连二亚硫酸钠(Na2S204)来模拟体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注,Annexin V/PI染色后,流式细胞仪检测正常大鼠肾细胞(NRK cells)凋亡率,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ppif基因(CypD的编码基因)的mRNA表达。(2)根据大鼠Ppif基因序列设计并化学合成3对siRNA及1对阴性对照siRNA,并在5'端标记FAM羧基荧光素,以脂质体Lipofectamine 2000转染入正常大鼠肾细胞(NRK cells),用RT-PCR和Westernblot分别检测其在正常大鼠肾细胞(NRK cells)中的Ppif基因和蛋白表达量的改变、验证所设计的siRNA的抑制效应。(3)以大鼠Ppif基因为靶基因,根据核糖核酸干扰(ribonucleic acid interfere, RNAi)序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的pGCL-Ppif即重组慢病毒载体转移质粒并对该基因的质粒进行测序鉴定及PCR鉴定。(4)建立SD大鼠肾缺血再灌注模型,将实验动物随机分为3组：空白组、阴性对照组、治疗组(各20只)。治疗组大鼠给Ppif基因靶向核糖核酸干扰(ribonucleic acid interfere, RNAi)慢病毒载体(4 ug/g)0.3 mL,阴性对照组再灌注时给予0.3 mL含体积分数0.01DMSO的生理盐水,空白组不夹闭肾蒂,余处理同阴性对照组。分别检测各组血肌酐(Cr)含量、细胞凋亡指数(AI)、尿素氮(BUN)含量、HE染色组织病理学分析。 结果：(1)去氧去糖40 mmin再复氧复糖后,正常大鼠肾细胞(NRK cells)凋亡率于16h达到最高值(P0.05)。Ppif mRNA在再复氧0 h时,Ppif mRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时表达水平明显升高,随再灌注时间延长,表达量逐渐增高,再灌注16 h时达高峰,48 h开始回落,各时段与0 h比较,均有统计学意义(P0.05)；(2)以脂质体Lipofectamine 2000转染所设计的siRNA进入正常大鼠肾细胞(NRK cells),转染效率90%。起始于405、556位点的siRNA在正常大鼠肾细胞(NRK cells)基因水平对Ppif无明显抑制效应(P0.05)；起始于198位点的siRNA正常大鼠肾细胞(NRK cells)在基因和蛋白水平均有明显的抑制效应,基因水平下降75.25%(P0.05)；蛋白水平下降72.13%P0.05)；(3)Ppif的短发夹RNA (small hairpin ribonucleic acid,shRNA)片段被成功克隆到pGCL-GFP慢病毒载体转移质粒中,并且4个插入的序列与我们之前设计的靶基因片段是一致的；(4)治疗组与阴性对照组比较,血BUN和Cr均明显降低,细胞凋亡指数(AI)明显下降,且有显著性差异(P0.05),HE染色组织病理学分析结果显著。 结论：(1)本模型可以模拟正常大鼠肾细胞(NRK cells)体内缺血再灌注机制,去氧去糖40 min后再复氧复糖16 h是体外正常大鼠肾细胞(NRK cells)缺血再灌注诱导凋亡的最佳条件,并验证了正常大鼠肾细胞(NRK cells)在缺氧再灌注模型中Ppif基因的表达。(2)起始于198位点的siRNA对正常大鼠肾细胞(NRK cells)的Ppif基因有明显的抑制效应。(3)成功的构建了慢病毒载体转移质粒,能够表达4个含Ppif靶基因片段,并且为进一步包装慢病毒载体(介导Ppif基因沉默)奠定了基础。(4)Ppif基因靶向RNAi慢病毒载体可以有效的抑制Ppif基因的表达,从而抑制线粒体的凋亡,减轻大鼠肾脏缺血再灌注损伤。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

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本文编号：2540557