转肽酶SrtA的表达纯化与结晶及其抑制剂的筛选

发布时间：2019-09-25 07:46

【摘要】： 被公认为“超级细菌”的金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,它广泛地存在于人类的皮肤和粘膜表面。通常金黄色葡萄球菌感染可以用内酰胺类、大环内酯类或者喹诺酮类抗生素对其进行有效的治疗。但是由于抗生素的滥用导致金黄色葡萄球菌产生了广泛的耐药性。抗生素危机已经成为了全球性的挑战,寻找结构新颖的全新型抗生素的研究已经迫在眉睫。具有毒力因子功能的细菌表面蛋白正在成为新的抗菌药物研究的候选靶标。研究思想是通过调控细菌表面蛋白与宿主的相互作用,干扰细菌对宿主的入侵感染。SrtA酶是一种膜结合巯基转肽酶,能识别表面蛋白C端所含的保守氨基酸基序LPXTG(X是指任意的氨基酸),并裂解苏氨酸(T)和甘氨酸(G)间的肽键,产生一个苏氨酸的羰基末端,与细胞壁的五个甘氨酸交联桥的氨基形成酰氨键,从而使表面蛋白被锚定到细胞壁的肽聚糖上。由于这种酶广泛存在于很多重要的人类病原菌内,如单核细胞增多型李氏杆菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌等,基于转肽酶的作用机制以及小分子抑制剂的研究,为解决针对金黄色葡萄球菌甚至广谱的细菌感染的化学治疗难题必将提供有力的理论依据。 SrtA酶由206个氨基酸组成,它的N端部分是一个跨膜区,C端部分则是一个催化区域。SrtAΔN59在体外与SrtA的功能相同,能够与底物LPXTG发生转肽反应,催化T和G之间的断裂。根据已知SrtA的基因序列,我们设计了两对SrtAΔN59基因序列的引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增。其中一个PCR产物经限制性内切酶BamhI和SalI双酶切后克隆到载体pQE30中,另一个PCR产物经限制性内切酶NdeI and XhoI双酶切后克隆到载体pET28b中。在大肠杆菌中表达重组蛋白SrtAΔN59,并利用AKTA纯化仪对其进行纯化,得到了纯度高于90%的SrtAΔN59蛋白。将纯化后的SrtAΔN59蛋白浓缩为50mg/ml,采用悬滴法筛选晶体,在Grid试剂盒的D4和D5得到了SrtA的晶体。为了筛选SrtA酶的小分子抑制剂,我们利用荧光共振能量转移的原理,合成SrtA酶的底物(O-aminobenzoyl -LPATG-diaminopropionic acid-dinitrophenyl-NH2, Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2)。当底物中LPATG没有被SrtA酶切断时,在一定波长的荧光的吸收很弱,但当其被SrtA酶切断后,则在此波长的荧光吸收将会大大增强。在筛选SrtA酶抑制剂的过程中,我们通过监测酶抑制反应后的荧光吸收值来判断小分子化合物的活性。最后我们筛选出3个具有较强的抑制活性,它们的IC50值分别为126.82μM、138.26μM和192.85μM。这项研究为以后SrtA抑制剂的发现和它们之间构效关系的分析奠定了基础。
【图文】：

表面蛋白,分选

使人或动物致病[52]。Mazmanian 等[41]以金黄色葡萄球菌 A 为模型，研究了表面蛋白 A 的锚定过程。表面蛋白 A 的保守氨基G 片段、一个疏水区域和尾部带电荷的氨基酸残基，这三个部分组成了酸残基的 C 端信号肽部分，被称为细胞壁分选信号(cell wall sorting s1 所示，N 端的特征信号肽则可以帮助表面蛋白分泌到细胞膜外[53]。

过程图,表面蛋白,锚定,酶催化

图 2 SrtA 酶催化表面蛋白锚定过程[56]Fig.2 Sortase catalyzed surface protein attachment[56]1：肽聚糖前体物 lipidII 在细胞质中合成；2：SrtA 将表面蛋白前体物中的分选信号断裂，并与断裂的分选信号形成酰基酶中间体；3：中间体受到 lipidII 中肽桥的亲核攻击，与之形成酰胺键；4、5：lipidII 与表面蛋白连接后经过转糖苷作用和转肽作用形成成熟的肽聚糖，，从而表面蛋白锚定到细胞壁的肽聚糖上。4.3 SrtA 的三维结构为了能够分析 SrtA 的活性和结构，我们需要得到高纯度的可溶 SrtA 蛋白，但是全长的 SrtA 蛋白的可溶性和稳定性都很差。Ton-That[54]发现将 SrtAN 端的信号肽部分用 6 个组氨酸进行替代，大大增强了 SrtA 的可溶性和稳定性，活性与原型基本保持一致。Ilangovan[45]等首先对 SrtA 的三维结构进行了初步探索，他们将SrtA 酶的 N 端截去 59 个氨基酸残基后得到 SrtAΔN59，并采用 NMR 衍射技术得
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378

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