人胚胎干细胞建系及线粒体和细胞骨架的分布模式与胚胎干细胞分化关系的研究

发布时间：2019-10-15 21:45

【摘要】： 目的 收集临床IVF剩余的正常受精胚胎、异常受精胚胎和植入前遗传学诊断异常的胚胎进行囊胚培养,分离培养新的正常hESCs以及疾病模型hESCs;研究早期胚胎、干细胞的自发分化和诱导分化过程中细胞骨架和线粒体的形成和分布特征,分析细胞骨架的变化以及线粒体数量形态的变化与胚胎干细胞分化的关系。 材料和方法 hESCs系的建立:胚胎来源于浙江大学附属妇产科医院生殖中心,患者签署了知情同意书后,使用其没有冻存价值的正常受精的废弃胚胎以及0PN,1PN,3PN和植入前遗传学诊断为异常的废弃胚胎。选择受精后5-7天内发育到扩张囊胚(expandedblastoeyst)的胚胎,用于内细胞团(Inner cell mass,ICM)的分离。使用机械法、免疫外科、全囊胚贴壁法分离内细胞团。随后进行ICM增殖物的离散、传代和扩增,冻存hESCs,并进行鉴定。 hESCs的鉴定:碱性磷酸酶活性染色、对细胞是否表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4进行免疫荧光鉴定、采用RT-PCR检测hESCs中干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4,Rex1等7个基因的表达情况,进行hESCs核型分析以及hESCs的三胚层体外分化实验。 线粒体和细胞骨架的动态观察:超排卵后收集不同发育阶段的卵母细胞和胚胎;常规hESCs培养,进行类胚体途径的ES自发分化;常规小鼠胚胎干细胞的培养和增殖与传代。参照Huang(2006)的RA诱导进行mES定向分化。常规免疫荧光技术进行线粒体(Mitotrack Red)和细胞骨架(FITC conjugated mouse anti-β-tubulin)的荧光染色。透射电镜的切片染色按照常规方法进行。 结果 1.从正常受精胚胎中分离了两株的hESCs分别被命名为ZJ01和ZJ02,从非正常受精胚胎分离了四株hESCs分别被命名为ZJ03、ZJ04、ZJ05以及ZJ06。所有干细胞呈典型的集落样生长,集落边缘光滑清晰,细胞排列紧密,细胞具有较高的核质比和2-3个明显的核仁;对干细胞进行鉴定,发现ZJ01,ZJ02,ZJ03,ZJ04干细胞的碱性磷酸酶活性染色强阳性,且均表达干细胞标志物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,OCT-4;RT-PCR检测表明,这两株干细胞表达干细胞特异性基因Nanog,TDGF1,Sox2,EBAF,Thy-1,FGF4和Rex1;核型分析结果表明,ZJ01,ZJ02,ZJ04干细胞系为正常的二倍体,ZJ03为4号染色体三体的干细胞,可作为疾病(染色体病)模型干细胞;体外分化实验证明,上述干细胞系具有向三胚层分化能力。 2.从合子到八细胞期,卵裂球内线粒体基本呈现均匀分布,没有极化现象;从桑椹胚到囊胚,卵裂球内细胞骨架结构明显,且线粒体的分布也从原来的均匀分布到极化分布; 4.未分化的干细胞中,微管蛋白及微管均均匀分布,干细胞开始发生分化后,微管蛋白的表达量及微管数量显著增加,随着分化程度的深入,微管结构出现;未分化的干细胞中,线粒体亦均匀分布于细胞质中,发生分化后,线粒体出现极化分布现象,明显分布在细胞的一端;类胚体中微管结构明显,线粒体集中分布在微管周围;RA诱导后,分化细胞的类型呈现不同的微管和线粒体的分布特性。 结论 1.成功构建两株正常hESCs和四株异常受精的疾病模型hESCs。 2.在干细胞以及早期胚胎细胞分化开始前,细胞质足够的细胞骨架蛋白以及细胞骨架结构的形成是细胞分化的必要前提;在不同胚层的分化过程中,细胞骨架分布模式具有特殊性,细胞骨架是细胞形态的决定因素,可能决定细胞分化方向,线粒体的分布模式能推断细胞分化的方向。
【图文】：

在胚层分化过程中，不同胚层的分化过程中线粒体的分布模式具有一定的规律.根据我们的研究结果，现提出线粒体体现细胞分化的两个基本模型(图3.28;图3.29).模型一:分化为内胚层的细胞中，线粒体集中分布在细胞核的一端，极化分布明显;模型二:分化为中胚层的细胞中，线粒体明显分布在细胞核的两端，亦呈明显的极化分布(两极分布).这种线粒体的分布特征，能墓本推断胚层分化的方向.哪骊图3.28干细胞类胚体途径分化模型一:线粒体沿着细胞骨架，呈聚集状分布于核的一端.这类分化细胞将来可能分化为内胚层细胞

图1.4机械法分离的ICM在HEF上贴壁生长的原代克隆增殖5天的ICM，原代克隆混有的TE较少;增殖7天的ICM，原代克隆呈巢式生长，与周围饲养层细胞分界图1.5新分离的2株hES细胞，10Ox免疫外科法分离ICM，以MEF为饲养层建立的hES一zJ01;(B
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 王克华,李娟,张琦,董云玲;胚胎移植前遗传学诊断及其对助孕技术的影响[J];国外医学.妇产科学分册;2001年02期

2 金帆,黄荷凤,叶英辉,邢来凤;单细胞的DOP—PCR—CGH分析[J];中国计划生育学杂志;1999年08期

3 徐晨明,金帆,黄荷凤,陶冶,叶英辉;全基因组扩增在DMD植入前遗传学诊断中的可行性研究[J];中国计划生育学杂志;2001年05期

4 Jason IE Bruce;;Plasma membrane calcium pump regulation by metabolic stress[J];World Journal of Biological Chemistry;2010年07期

5 邢兰凤;许小萍;;植入前遗传学诊断的护理[J];中国实用护理杂志;2006年17期

6 徐晨明 ,金帆 ,黄荷凤 ,陶冶 ,叶英辉;Single Cell Analysis of Dystrophin and SRY Gene by Using Whole Genome Amplification[J];Reproduction & Contraception;2001年03期

7 王秀珍,韩志强;花粉中微管与花粉管伸长及其胞质颗粒运动的关系[J];作物学报;1995年02期

8 李汶,卢光t;植入前遗传学诊断的原理、方法及适应症[J];遗传;2002年03期

9 金帆;SINGLE CELL DEGENERATE OLIGONUCLEOTIDE PRIMER-PCR AND COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION WITH MODIFIED CONTROL REFERENCE[J];Journal of Zhejiang University Science;2001年03期

10 徐晨明,金帆,钱羽力,叶英辉,朱依敏,黄荷凤;应用荧光原位杂交技术进行植入前胚胎染色体诊断的价值[J];中华妇产科杂志;2004年07期

相关博士学位论文 前4条

1 张云山;性连锁遗传病和HLA基因型的植入前遗传学诊断[D];天津医科大学;2010年

2 叶小群;肺癌干细胞的分离鉴定及线粒体能量代谢特性的研究[D];第三军医大学;2011年

3 岳顺利;单卵裂球建立小鼠胚胎干细胞系的研究[D];东北农业大学;2010年

4 黎青;DMD基因诊断体系建立、应用和羊水iPSCs构建[D];南方医科大学;2013年

相关硕士学位论文 前3条

1 姚宁;不同方法生产的牛早期胚胎干扰素-tau基因mRNA表达活性分析[D];中国农业大学;2005年

2 肖骧;两种细胞骨架及其相关马达蛋白在日本沼虾精子发生过程中作用的分子机制[D];浙江大学;2007年

3 孙博;人废弃胚胎群体培养及胚胎干细胞系的建立[D];郑州大学;2013年

，

本文编号：2549847