新一代HIV DNA疫苗优化设计及DNA疫苗导入技术的研究

发布时间：2019-10-18 07:05

【摘要】： DNA疫苗安全可靠,可以同时诱导体液免疫和细胞免疫,是具有广阔应用前景的新型疫苗。但目前多数处于临床试验阶段的DNA疫苗尚存在诸多缺陷,最主要的问题是免疫原性较差。如何有效提高DNA疫苗的免疫原性是DNA疫苗研究领域亟待解决的问题。本课题对DNA疫苗优化设计与DNA疫苗导入技术两个方面进行了探索。在疫苗构建方面,对本实验室现有的DNA疫苗载体pDRVISV1.0进行优化,删除非必要序列,构建了DNA疫苗载体pDRV14.0,并在此基础上构建了带有HIV-1Env、Gag、Pol和TNR基因的DNA疫苗质粒p4.0Env、p4.0Gag、p4.0Pol和p4.0TNR,使用DNA疫苗p1.0Env和p4.0Env免疫小鼠,运用ELISPOT法检测两种疫苗的免疫原性,结果显示删除非必需序列对DNA疫苗免疫原性无明显影响。在pDRVI4.0载体基础上,本课题构建了同时表达两种抗原基因的双顺反子DNA疫苗p4.0AEnvTNR和p4.0AGagPol。在小鼠模型,我们对比了双顺反子DNA疫苗与两个单顺反子疫苗质粒混合免疫所诱导的免疫反应,对比了两种双顺反子DNA疫苗混合免疫混合免疫与四种单顺反子DNA疫苗质粒混合免疫的免疫原性。结果显示,双顺反子DNA疫苗的免疫原性与单顺反子DNA疫苗混合免疫无显著性差异。此外,还构建了启动子方向相同和相反的双顺反子DNA疫苗p4.0SEnvPol、p4.0SGagTNR、p4.0AEnvPol和p4.0AGagTNR,并在小鼠模型中进行对比,发现启动子的方向对DNA疫苗的免疫原性无显著性影响。在DNA导入技术方面,本首先对基因枪导入参数进行了优化,包括剂量和次数。结果表明,HIV-1 p1.0Env DNA疫苗基因枪免疫的最优剂量为2.25μg,最佳免疫次数为3次。在此基础上,我们对基因枪免疫和电穿孔导入技术对报告基因表达和DNA疫苗免疫原性的增强效果进行了对比。本课题构建了带有萤火虫荧光素酶基因的DNA疫苗质粒pDRVISV1.0Luciferase作为报告质粒注射小鼠,利用可见光体内活体成像技术检测萤光素酶报告基因在小鼠体内的表达,结果表明基因枪轰击1μg剂量的报告质粒产生的基因表达水平10倍于肌肉注射50μg质粒所产生的表达。使用电穿孔导入技术可获得比同剂量质粒肌肉注射高近5倍的报告基因表达。相应的,在诱导抗体反应方面,基因枪免疫也比电穿孔投送更有优势。但是,基因枪免疫诱导的免疫反应类型非常偏向Th2型,其抗原特异性T细胞免疫的能力很弱。而基因枪免疫则均衡而显著地增强了抗原特异性T细胞和抗体免疫反应。对于HIV DNA疫苗来说,体内电穿孔技术是较理想的质粒DNA投送技术。经本课题的综合优化,新一代HIV DNA疫苗的免疫原性得到了大幅度的提高,为下一步临床前研究和临床试验奠定了坚实的基础。
【图文】：

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图1:吹氮干燥仪示意图 TubmgPrePStation3)子弹的干燥与切割:吹氮干燥仪各结构如图1所示;a)连接吹氮干燥仪的电源和导气管，压迫弹性机构①，取下转导管②，打开氮气钢瓶的阀门，调节减压阀，使输出压力为ZMPa，打开减压阀⑦精调压力，观察压力表⑥，使示数为0.2MPa;b)将子弹管的一头插入密封套⑩，另一头插入另一端孔中，流量计⑤开关到0.3一O.4L/min，空吹10一15min;c)将子弹管的出口端依次套上连接用管和10ml注射器，，将子弹管的另一端从密封圈拔出

顺反子,DNA疫苗

在的增强子作用，在多克隆位点下游即目的基因的3’端带有牛生长激素PofyA加尾信号，该信号可以增加转录后的mRNA的稳定性使目的基因的表达效率。DNA疫苗构建流程如图2和图3所示。具体构建方法如下:l)单顺反子DNA疫苗的构建以pD又叮SVI.o为模板，运用PCR并结合克隆的方法(所用PCR引物、各工具酶反应条件详见表2、表7，)，扩增复制子CofEI和卡那霉素抗性基因Kan，使用限制性内切酶Bgln和BsrGI双酶切(酶切位点通过引物5’端引入)，连接转化后得到质粒pBasic;以PDRVISVI.Ose为模板，运用PCR的方法扩增表达盒，以ExpFI和ExpRI为引物的扩增产物和pBasie用Ec0RI和Kvnl双酶切
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392.1

【参考文献】