ARG1基因真核表达载体的构建及其对细胞抗砷性影响的研究

发布时间：2019-10-24 01:50

【摘要】：目的：通过构建ARG1基因真核表达载体PcDNA3.1-IE-ARG1,转染293T细胞来研究ARG1基因的抗砷性。 方法：采用脂质体介导的转染方法将PcDNA3.1-IE-ARG1转染入293T细胞中,用激光共聚焦显微镜和real-timePCR方法进行ARG1基因表达鉴定；MTT法检测48小时急性砷中毒时细胞的生存率；原子吸收分光光度法测定不同浓度(1.4、8μmol/L)砷作用于PcDNA3.1-IE-ARG1组、空载体组及未转染组细胞24h后,细胞内砷含量及细胞分别在24小时、48小时的排砷量；用含NaAsO2浓度为0、4、8μmol/L的培养基培养三组细胞48小时,二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定细胞内谷胱甘肽(GSH)含量及谷胱甘肽转移酶(GST)活性,蛋白印记法测定细胞内多药耐药相关蛋白2(MRP2)的表达。 结果：PcDNA3.1-IE-ARG1成功转入293T细胞中且表达良好；48小时急性砷中毒试验显示各组细胞生存率均明显下降,存在剂量-效应依赖关系,随着砷浓度的增加,各组细胞在各浓度下的生存率都逐渐降低；但PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞在低浓度(砷浓度≤8μmol/L)砷作用下,生存率均明显高于其它两组,差异具有统计学意义(P0.05)；用浓度为1、4、8μmol/L的NaAsO2作用细胞24小时,PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞内砷含量明显降低,24小时、48小时的排砷量明显增高,与其它两组相比差异具有统计学意义(p0.05)；用浓度为0、4、8μmol/L的NaAsO2作用细胞48小时后,PcDNA3.1-IE-ARG1组细胞内GSH与GST的含量及MRP2蛋白表达明显增高,与其它两组相比差异具有统计学意义(p0.05),且随着砷作用剂量的增加GSH.GST及MRP2表达亦增加。 结论：ARG1基因在293T细胞中相对高表达后,提高了293T细胞对砷的耐受性。
【图文】：

溶液转化大肠杆菌DHS。感受态细胞，37℃培养过夜，随机挑取单克隆菌落作为模板，PCR产物在 1.0%琼脂糖凝胶中电泳，结果在 NDAmarkerZkb与1.2kb之间扩增出特异性条带(见图1)。1.2重组质粒的双酶切鉴定及测序:为了鉴定含有ARGI基因开放阅读的真核表达载体构建是否成功，我们将上述扩增出特异性条带的菌落培养后提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切后进行电泳，结果在DNAmarker大于 1.2kb处出现2条特异扩增条带，分别与空载体PcDNA3.l一IE和ARGI基因开放阅读框理论值(大小5.4kb左右和1532bP)进行比对，结果相符(见图2)。将克隆进行双向测序，结果显示DNA序列与GenBank发表的ARGI基因开放阅读序列完全一致(见附录)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb图1质粒转化菌的菌落PCR产物电泳图图2重组质粒双酶切电泳图2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T细胞中的表达及鉴定2.1形态学观察PcDNA3.1一IE一ARGI转染前后293T细胞为了解转染目的基因后，是否影响细胞形态，我们在倒置显微镜观察293T细胞形态变化

特异性条带的菌落培养后提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切后进行电泳，结果在DNAmarker大于 1.2kb处出现2条特异扩增条带，分别与空载体PcDNA3.l一IE和ARGI基因开放阅读框理论值(大小5.4kb左右和1532bP)进行比对，结果相符(见图2)。将克隆进行双向测序，，结果显示DNA序列与GenBank发表的ARGI基因开放阅读序列完全一致(见附录)。4。skb4.skbZkb 1.2kb2kb 1.2kb图1质粒转化菌的菌落PCR产物电泳图图2重组质粒双酶切电泳图2.PeDNA3.1一IE一ARGI在293T细胞中的表达及鉴定2.1形态学观察PcDNA3.1一IE一ARGI转染前后293T细胞为了解转染目的基因后，是否影响细胞形态，我们在倒置显微镜观察293T细胞形态变化，结果293T细胞生活状态下呈梭形、三角或多角形。转染后细胞形态没有明显改变(见图3一A、B、C)。由于重组质粒PcDNA3.1一IE一ARGI带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)，所以本研究通过激光共聚焦显微镜观察EGFP的表达来间接反映ARGI基因转染情况。转染24h后，重组质粒组细胞中可见特异性EGFP绿色荧光，且绿色荧光蛋白分布于细胞膜附近;空载体组绿色荧光蛋白分布于整个细胞(见图3一D、E、F)，转染率为70%以上。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

【参考文献】

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本文编号：2552333