一氧化氮对金黄色葡萄球菌生物膜影响的研究
发布时间：2019-10-24 05:12
【摘要】： 一氧化氮(nitric oxide,NO)是生物体内重要的活性分子。NO参与了生物体内细胞的分化和凋亡、血管松弛、神经传递、免疫防御反应以及种子萌发、下胚轴伸长、叶扩展、根生长等许多重要生理过程,被认为是多功能的第二信使。NO在动物体和高等植物中的研究早已受到广泛的重视,但是NO在细菌中,尤其是在细菌形成的多细胞结构—细菌生物膜(biofilm)中的作用却极少有人研究。细菌生物膜是由细菌和其分泌的胞外基质在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构,是细菌产生抗生素耐药和逃避机体免疫系统攻击的主要原因。金黄色葡萄球菌(S. aureus)是院内感染的重要病原体之一,其致病机理与其生物膜的生成密切相关。本论文旨在研究NO对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响,为进一步研究NO在生物膜中的作用和机制奠定了基础。 首先,利用实时荧光定量PCR检测了S. aureus生物膜和浮游细菌中一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)基因nos的mRNA表达水平,结果表明生物膜中nos的表达量明显高于浮游菌,表明NO可能对生物膜的形成具有重要作用。为了检测NO对生物膜的影响,通过外源加入NO供体SNP和NO清除剂PTIO观察细菌生物膜的变化。结果表明SNP能够明显促进S. aureus生物膜的生长,而加入NO清除剂PTIO后能够抑制SNP引起的生物膜的增加。 为了进一步研究NO对生物膜的影响,利用同源重组方法构建了S. aureus nos基因缺失突变株。在突变株的构建过程中,我们发现由于S. aureus细胞壁厚而致密而且穿梭重组质粒较大,使用目前的常规转化方法无法导入外源性DNA,限制了遗传操作的进行。为了提高转化效率,我们利用溶菌酶、溶葡萄球菌酶或Triton X-100在电击转化前对细菌进行预处理,使转化效率显著提高,最高达到1.7×10~3cfu/μg DNA,从而建立了一种简便、高效的转化方法。同源重组载体pMADΔnos的构建是将PCR获得的nos基因上下游同源序列和壮观霉素抗性基因连入穿梭载体pMAD。pMADΔnos载体首先转入S. aureus RN4220,经修饰后转入S. aureus RN6390,利用温度敏感性和抗生素抗性筛选同源重组体,成功构建了S. aureus RN6390 nos基因缺失突变株。生物膜形成实验表明nos缺失突变株的生物膜形成能力明显减弱,其生物膜的量比野生型减少了30%以上;最低生物膜消除浓度(MBEC)试验表明突变株生物膜对抗生素的敏感性提高为野生型的两倍。 综上所述,本论文建立了一种简便高效的S. aureus外源DNA转化方法,并利用同源重组技术构建了S. aureus的nos基因缺失突变株。研究结果证明,外源NO促进了S. aureus生物膜的生长,而nos基因的缺失可以抑制S. aureus生物膜的生长并增强生物膜对抗生素的敏感性。本论文揭示了NO对金黄色葡萄球菌生物膜的作用,为深入研究NO在细菌生物膜形成过程中的作用和机制提供了实验基础和理论依据,同时,为细菌生物膜形成的调节机制和细菌生物膜相关感染的预防和治疗提供了新的思路。
【图文】：
图 1 NO 的生物合成在 NO 的生物合成中，NOS 是主要的限速因子，根据 NOS 基因序列和细胞同分为 3 型[7-9]:内皮型 NOS(eNOS)为内皮细胞所特有；神经元(macNOS)主要存在于中枢神经、外周神经系统；诱导型 NOS(iNOS)主要存噬细胞中。根据NOS调节方式及特点主要分为2型，即组成型NOS(constituti，cNOS)和诱导型 NOS(inducible NOS，iNOS)，其中 eNOS 和 nNOS 合称为 NOS(cNOS)，macNOS 为 iNOS。cNOS 需要依靠钙离子或钙调蛋白激活、NADPH 的参与才能将 L－精氨酸胍氨酸，释放 NO。cNOS 的单体就具有生物活性，由于催化发应迅速而短暂的 NO 少，人们认为它能参与传递介质和调节介质。iNOS 在内毒素或某些细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、γ－干扰素(INF－激及四氢生物喋呤和 NADPH 作用下可被激活，该过程一般需要 4－6 小时性的单体 iNOS 分子量为 130KD，只有在形成分子量为 25OKD 的二聚体时
一氧化氮对金黄色葡萄球菌生物膜影响的研究cAMP 的含量[16-18]。作为一种新型的神经递质，NO 与传统神经递质存在区别[19]:传统神经递质贮存在突触小泡中以胞泌方式释放，作用时间短暂快速而且作用于受体能引起离子通道的开放。NO 分子结构简单，而且有毒性；只在需要时才合成，不贮存在突触小泡中，广泛分布与胞浆内；通过扩散进入邻近神经元，，作用于细胞内可溶性鸟苷酸环化酶亚铁原卟啉上的铁离子，从而实现各种不同的生理功能。2.3 动物中 NO 的信号转导NO 是一种较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜作用于细胞内的靶分子，并以相对特异方式控制多种细胞的功能，NO 的细胞内信号转导途径研究首先而且主要是在动物中进行的，目前普遍认为，动物体内 NO 的信号转导通路分为环鸟苷酸(cGMP)依赖途径和非 cGMP 依赖途径两种类型[20]，如图 2 所示：
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R378
本文编号：2552400
【图文】：
图 1 NO 的生物合成在 NO 的生物合成中，NOS 是主要的限速因子，根据 NOS 基因序列和细胞同分为 3 型[7-9]:内皮型 NOS(eNOS)为内皮细胞所特有；神经元(macNOS)主要存在于中枢神经、外周神经系统；诱导型 NOS(iNOS)主要存噬细胞中。根据NOS调节方式及特点主要分为2型，即组成型NOS(constituti，cNOS)和诱导型 NOS(inducible NOS，iNOS)，其中 eNOS 和 nNOS 合称为 NOS(cNOS)，macNOS 为 iNOS。cNOS 需要依靠钙离子或钙调蛋白激活、NADPH 的参与才能将 L－精氨酸胍氨酸，释放 NO。cNOS 的单体就具有生物活性，由于催化发应迅速而短暂的 NO 少，人们认为它能参与传递介质和调节介质。iNOS 在内毒素或某些细胞因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、γ－干扰素(INF－激及四氢生物喋呤和 NADPH 作用下可被激活，该过程一般需要 4－6 小时性的单体 iNOS 分子量为 130KD，只有在形成分子量为 25OKD 的二聚体时
一氧化氮对金黄色葡萄球菌生物膜影响的研究cAMP 的含量[16-18]。作为一种新型的神经递质，NO 与传统神经递质存在区别[19]:传统神经递质贮存在突触小泡中以胞泌方式释放，作用时间短暂快速而且作用于受体能引起离子通道的开放。NO 分子结构简单，而且有毒性；只在需要时才合成，不贮存在突触小泡中，广泛分布与胞浆内；通过扩散进入邻近神经元，，作用于细胞内可溶性鸟苷酸环化酶亚铁原卟啉上的铁离子，从而实现各种不同的生理功能。2.3 动物中 NO 的信号转导NO 是一种较小的生物活性分子，可自由穿过细胞膜作用于细胞内的靶分子，并以相对特异方式控制多种细胞的功能，NO 的细胞内信号转导途径研究首先而且主要是在动物中进行的，目前普遍认为，动物体内 NO 的信号转导通路分为环鸟苷酸(cGMP)依赖途径和非 cGMP 依赖途径两种类型[20]，如图 2 所示：
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R378
【引证文献】
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1 李蕾;金黄色葡萄球菌isdA缺失株的构建及其免疫活性的研究[D];吉林大学;2012年
本文编号：2552400
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