C5aR稳定表达株的构建及其功能研究

发布时间：2019-11-08 14:53

【摘要】： 前言 G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR)自然界中最大的蛋白质家族成员之一,存在于从低等动物酵母至人类器官,据统计大约1%的人类基因组编码GPCRs而30%的药物是以GPCRs为靶点设计的。GPCR由一条400~600个氨基酸组成的多肽链构成,这条多肽链有7个分肽段穿越细胞膜形成7个跨膜区(transmembrane domain,TMD)。补体裂解片段C5a受体(The complement C5 anaphylatoxin receptor , C5aR;CD88) GPCR家族成员之一,是7次跨膜α螺旋受体,其N端在细胞外侧,含有N-糖基化位点; C端在细胞内,其上有磷酸化位点。中段七个分肽段穿越细胞膜形成7个跨膜区,它们藉6个细胞外与细胞内由亲水性氨基酸构成的突环连接起来。细胞外3个分别称为e1、e2及e3;细胞内3个分别称为i1、i2及i3。e1和e2之间由两个保守的Cys形成一个二硫键。不同GPCR的TMD为分子的保守区,具有极大的相似性,而两端区域及突环的氨基酸则变异程度较大。 C5aR主要表达于中性粒细胞,嗜碱性粒细胞及单核细胞上。野生型的C5aR的表达细胞分离困难,对C5aR的功能及信号事件的研究较难进行。体外建立一个有生物学活性,稳定表达C5aR的细胞株对我们进一步研究C5aR的生物学功能有很大的意义。 目的 构建重组人C5aR的真核表达载体并将其转染入含有Gα16基因的Molt-4细胞中,获得一株稳定表达C5aR的细胞株。为以后继续探讨C5aR的生物学功能以及C5aR单克隆抗体的制备奠定基础。 方法 通过RT-PCR从人中性粒细胞中钓取C5aR全长基因,重组到pGEM-T Easy vector中进行基因克隆,经核酸序列测定正确后,将其克隆入真核表达载体pcDNA4.0中,转染至Molt-4细胞系并对其进行稳定筛选。通过Zeocin加压及亚克隆筛选获得稳定表达C5aR的细胞株。Westen blot检测了人标准C5a对Molt-4/C5aR细胞的激活作用,细胞内钙离子流动检测了Molt-4/C5aR细胞经C5a刺激后第二信使钙离子的调动情况,小鼠肺灌洗实验检测Molt-4/C5aR细胞的趋化情况。 结果 构建了真核表达载体pcDNA4.0/ C5aR的构建并将其转染至Molt-4细胞。利用流式细胞术对C5aR的表达进行了检测,正常人新鲜血液中中性粒细胞上的C5aR表达率为98.25%,而此稳定株C5aR的表达率为97.35%,几乎等同与正常人新鲜血液中中性粒细胞上C5aR的表达量。PCR技术及Westen blot鉴定了转染后的细胞株中仍有Gα16的存在。Westen blot显示了人标准C5a对Molt-4/C5aR细胞的激活作用,引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化。细胞内钙离子流动结果显示了Molt-4/C5aR细胞经C5a刺激后第二信使钙离子的调动,小鼠肺灌洗实验说明Molt-4/C5aR细胞对C5a很好的趋化情况。 结论 构建了重组形式的C5aR真核表达载体pcDNA4.0/C5aR,并成功转染至Molt-4细胞中。通过RT-PCR发现MOLT-4/C5aR细胞株中Gα16没有丢失并能够正常表达Gα16蛋白,可以进行细胞的信号及功能研究。Westenblot试验结果显示MOLT-4/C5aR细胞株经C5a刺激后能够引起ERK1/2及PKB/AKT的磷酸化,这更有利于我们对信号转导通路进行更进一步的研究并探索新的未知因子。C5a刺激MOLT-4/C5aR细胞株后可以引起钙离子的显著变化,并且有一定的时间和剂量依赖性。小鼠肺灌洗实验说明Molt-4/C5aR细胞对C5a很好的趋化情况。
【图文】：

16图1.2真核表达载体酶切鉴定Fig1.2: Identification of pcDNA4.0/ C5aRM:DL2000 Marker 1-5: pcDNA4.0/ C5aR4.3 真核表达质粒的转染取对数生长期的 Molt-4 细胞，计数细胞，并调整浓度为 1×107 个/ml。实验中首先稳定电压为 280V，调整电击时间为 10ms、20ms、30ms、40ms；然后，固定电击时间为 40 ms，调整电压为 220V、240V、260V、280V。电击后分别培养 1h 及 48h 后计数细胞的存活率。根据电击后细胞活率为 50％左右时可以达到最佳的电转效果，，选择合适的 260V 电压及 20ms 电击时间。同时试验中选择了每次 5μg 、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg 或 40μg 质粒转染，观察转染的阳性率以及细胞的平均荧光强度。确定了转染及表达阳性率较高的合适质粒量 30μg。M 1 2 3 4 5bp20001000750500250100不同电压电击40ms?

(a) (b)图1.6 C5aR的表达情况Fig1.6 The expression of C5aR proteinFig1.6 (a) Negative control(Molt-4/ pcDNA4.0).(b) The expression of C5aR protein in Molt-4/C5aR cell5 讨论补体激活产物C5a是一种重要的前炎症介质，发生严重感染时过度产生5a血浆中可以达到10-100nM水平，此时可触发细胞因子/趋化因子瀑布反应致全身炎症反应综合症(SIRS)，这与器官潜在的损伤和多器官功能不全综合MODS)相关[13]。本研究就是通过分离正常人的外周血中性粒细胞，TRAIZOL法提取总R
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

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本文编号：2557899