人源H5N1禽流感病毒株HA1蛋白抗原表位分析及在人靶细胞上复制能力差异的分子机制研究

发布时间：2019-11-23 12:49

【摘要】： 禽流感病毒(AIV)属正粘病毒科A型流感病毒,禽流感病毒尤其高致病性的H5N1型禽流感病毒已经跨越种属屏障直接引起人类感染并致感染者死亡。1997年首次发现H5N1流感病毒从禽感染到人并引起死亡,之后不断有散发感染病例出现。特别是2003年底以来,世界上已有15个国家和地区报告有高致病性H5N1型流感病毒感染人的病例,已有423人感染,其中258人死亡,死亡率高达61%。虽然主要集中在亚洲,但欧洲和非洲也有感染病例出现,并且在上述国家和地区同时出现大规模家禽感染死亡,对人类健康和经济发展都造成了巨大影响,引起了各国的高度关注。 A型流感病毒颗粒表面存在两种由糖蛋白组成的棘突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),依靠它们可以把A型流感病毒分成很多亚型。同时,由于它们是流感病毒的主要表面抗原蛋白,可以刺激机体诱导产生免疫保护,又由于它们的变异可致流感病毒发生抗原漂移和转换,产生新的亚型和变异株,对这两个蛋白,特别是血凝素(HA)抗原性的研究,不但可以揭示流感病毒的抗原变异规律也可为疫苗的研发提供理论指导。已有研究证明,H5亚型上至少5个中和抗原表位(A、B、C、D和E)均位于HA的重链区HA1,各表位之间存在着一定程度的氨基酸区域重叠,但其区域大小及精细结构尚未确定。为进一步探索H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其结构功能,深入了解病毒的免疫保护抗原及病毒的致病机制,我们开展了H5N1禽流感病毒HA蛋白的抗原表位及其结构功能的研究。本研究的思路是:利用我们自行从人感染标本中分离的人源H5N1禽流感病毒株A/Beijing/01/03,制备多克隆血清抗体和多株特异性单克隆抗体,同时将该病毒的HA基因片段进行分段表达,利用多克隆和单克隆抗体分析各肽段的免疫反应性来鉴定及定位HA上的相关抗原表位,分析抗原表位的功能,确定单抗识别的氨基酸序列及表位构象。通过用单抗对流感病毒HA的抗原表位进行精细分析,为研发新型重组疫苗和多表位疫苗提供理论指导。此外,为了探索H5N1病毒跨越种属屏障直接从禽类感染人类的分子基础,我们又进行了10株人及野鸟H5N1分离株在人靶细胞上复制能力及拮抗人细胞因子等的差异研究。首先,我们根据人H5N1病毒A/Beijing/01/03株的HA1基因编码区984bp的序列,利用生物分析软件Oligo6.0设计了17条引物(共16对),采用常规PCR方法,利用这些引物分别扩增出HA1的16个不同长度的重叠肽的基因片段。利用限制性内切酶双酶切,将16条不同长度的HA1基因片段克隆到pDisplay载体中,筛选阳性克隆并测序鉴定,构建了16个重组质粒pDisplay-HA1-1~10及pDisplay-HA1-1’~6’。测定16个真核表达重组质粒的浓度及纯度,转染HeLa细胞,各HA1蛋白重叠肽段均获得成功表达。将表达各HA1重组肽段的细胞制备成各HA1肽段抗原片,建立起间接免疫荧光检测方法,用于抗原表位分析。其次,我们制备了抗H5N1(A/Beijing/01/03株)的单克隆抗体和多克隆抗体并对其性质进行研究。用甲醛灭活的病毒鸡胚尿囊免疫动物三次后,对小鼠血清检测出现特异性抗体者,取脾进行细胞融和实验,有限稀释克隆法筛选单克隆抗体细胞株,建立了12株稳定分泌抗AIV抗体的杂交瘤细胞。对自行制备的12株单抗和车小燕研究员惠赠的18株单抗的免疫学特性如抗体效价、血凝抑制活性、中和效价、单抗对HA蛋白特异性的识别等进行了鉴定。结果显示,应用间接免疫荧光方法测定全部30株杂交瘤腹水效价均在320-20480之间;发现13株McAb对病毒有较高的血凝抑制活性;用单抗对表达的HA1全长肽段进行识别检测,发现18株单抗对HA蛋白是特异性的;采用微量细胞培养中和试验测定了18株抗HA1单抗,6株具有中和抗体活性,中和效价在1㑳52~1㑳2032之间。同时,用灭活病毒免疫小鼠,成功地制备出了高效价的鼠抗H5N1多克隆血清抗体。第三,利用H5N1病毒特异性单抗及多克隆血清抗体采用间接免疫荧光法检测表达的禽流感病毒HA蛋白重叠肽抗原,分析HA的抗原表位及优势抗原表位。将每株单抗分别与16个表达的HA1重叠肽段结合,确定单抗识别的肽段区域,并对单抗的识别表位特征进行分析。同样方法,利用制备的多抗与表达的HA1各重叠肽段进行结合反应性分析,确定HA蛋白上的优势抗原区域。初步分析确定3B5、3D1、3B2、M6、M3等18株单抗识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143,aa155-165,aa166-196,aa166-176,aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等单抗识别的表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的单抗所识别表位为构象性中和表位。将18株单抗识别的抗原表位在HA分子一级和三级结构上进行定位,确定了它们在三维HA中的位置。通过分析,初步确定HA1蛋白的优势抗原表位区为aa133-165 ,序列为IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。这些结果为进一步了解HA抗原表位相关结构与功能的关系提供了重要数据,对探索流感病毒抗原变异规律和新型疫苗的研发具有一定的理论意义。第四,对A/Beijing/01/03等10株人及野鸟源H5N1病毒在人体靶细胞上复制能力差异的分子机制进行了研究。首先进行了人及野鸟H5N1病毒分离株空斑滴度测定,又进行了10株分离株在人A549细胞上复制能力以及对人IFN和TNF等细胞因子的敏感性检测,并对病毒基因组全序列进行分析。结果显示,人H5N1病毒株跨越种属屏障感染人可能与其在人体靶细胞的高效复制能力有着密切关系;初步确定NS1蛋白上三处氨基酸残基的突变可能与病毒适应人细胞复制有关。成功的构建了人H5N1病毒(A/Vietnam/1194/2004)株NS1基因突变株,为H5N1病毒适应并引起人类严重感染的分子生物学研究奠定了一定的基础。通过上述研究,获得以下结果:1、成功地构建了一批表达HA不同长度肽段的质粒,并转染LeLa细胞,获得了真核细胞表达,制备了一批抗H5N1病毒的单克隆抗体,并对单抗进行了特性研究。这些肽段和单抗对研制甲型流感病毒特异诊断试剂具有重要的应用价值;2、利用单抗和不同长度的HA肽段对HA上抗原表位分析初步证明,HA1上存在着血凝型、非血凝型和中和型等多种抗原表位,血凝型抗原表位主要为序列依赖性表位;3、通过构象分析证明,中和型表位主要为构象表位;4、通过优势抗原表位分析,确定HA1蛋白的优势抗原表位区为aa133-165,序列为IPKSSWSNHEASSGVSSACPYLGRPSFFRNVVW。这些结果为进一步了解HA抗原表位相关结构与功能的关系研究提供了重要数据,对探索流感病毒抗原变异规律和新型疫苗的研发具有一定的理论意义。对A/Beijing/01/03等10株人及野鸟H5N1病毒在人体靶细胞上复制能力差异分子机制的初步分析发现,人源H5N1病毒在人细胞上复制能力强,可能是H5N1病毒感染人类的前提。NS1蛋白效应区上3处氨基酸残基突变可能与病毒适应人体复制相关,这对进一步探索H5N1病毒的分子生物学致病机理提供了可参考的资料。
【图文】：

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1968 年毒株（H3N2）HA 分子的抗原表位结构图the solved structure of a 1968 strain of HA(H3 subtype，HA 由 329 氨基酸残基组成的重链 HA1 和 175 个氨基酸构成。在 HA 分子上通常确定有五个抗体结合表位：A（红D（浅蓝），E（深蓝），均位于 HA1。蛋白上五个抗原表位区域（A-E）都已经鉴定及序列测位。试验及分析表明，可能由于抗体选择压力，病毒其他区域快，特别是优势表位突变最快。Mu oz等通表位内氨基酸位点突变率的统计观察来确定相关的变率分别为 0.053 ， 0.14 ， 0.037 ， 0 ， 0.09 ，推断/99 HA蛋白上为占优势的表位，E表位为次优势表位。抗原变异病原体的典型范例,似乎有逃避免疫应答的年造成 50 万人死亡。抗病毒表面糖蛋白 HA 的抗体性，并且 HA 是流感疫苗的主要组分。但是 HA 的抗

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17图2 pDisplay载体结构图Fig.2 The features and the multiple cloning site of pDisplay1.4 引物设计及合成根据人H5N1病毒株A/Beijing/01/03株的HA1基因编码序列，真核表达载体pDisplay的基因图谱和其多克隆酶切位点图谱（图2），利用生物分析软件Oligo6.0确定上游和下游的酶切位点分别为SacⅡ和SalⅠ。设计17条引物（见表1，其中Primer 1和Primer 11为通用引物），扩增16种HA1蛋白相互重叠的基因序列。扩增引物由上海生工生物工程技术公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为20μM的储存液，，-20℃保存备用。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392.1

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