【摘要】： 目的:①.通过联合应用马血清(Equine Serum,ES)和低剂量甲基强的松龙(methylprednisolone,MPS)的方法,探讨建立激素性兔股骨头缺血性坏死动物模型的可行性;②.体外分离、接种、培养、扩增兔ASCs并鉴定,观察其生物学特性并探讨其体外培养适宜条件;③.观察长期传代对ASCs诱导成骨分化的影响,以探讨ASCs在组织工程和再生医学上的应用前景。 方法:①.20只健康日本大耳白兔随机分成实验组和对照组(A组和B组),A组14只动物第1次通过兔耳缘静脉按10ml/Kg量注入马血清,间隔2周后,连续2天按5ml/Kg再次注入马血清,第1次注射马血清24小时后即于臀肌注射4mg/KgMPS,以后每隔1周注射1次,共8周。B组6只动物单纯注射同等量的生理盐水,所有的动物饲养在动物笼中并给予标准的食物和水喂养。于第1次注射马血清前、注射MPS后2周、4周、8周行血液学检查。并分别于注射MPS后4周和8周行X线影像学、MRI检查、HE染色和电镜观察股骨头缺血坏死情况。 ②.用Ⅰ胶原酶消化取自兔颈后部的皮下脂肪组织,采用含胎牛血清的DMEM进行体外培养。比较不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间对兔ASCs体外培养生长特性及增殖能力的影响。免疫荧光检测ASCs表面标记物的表达,通过成骨和成脂诱导剂诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化,Von Kossa染色和碱性磷酸酶染色鉴定成骨分化,Oil Red O染色鉴定成脂分化情况。 ③.将传至3、6、9、12、15代的ASCs通过rhBMP-2向成骨诱导,诱导培养1周、2周后,行Von Kossa钙结节染色及CAKP染色鉴定细胞成骨分化,并检测成骨标志产物AKP的活性和Ca+离子的浓度,检测ASCs长期传代对其成骨能力的影响。 结果:①.实验组因急性全身免疫反应死亡2只动物,余动物均存活并顺利通过实验。甘油三酯、胆固醇在2周、4周、8周时均明显上升,与对照组比较均有统计学意义(P0.05);激活部分凝血活酶时间(Actived partial thromboplastin time,APTT)则明显下降,与对照组比较有统计学意义(P0.05)。造模2周时X线表现与对照组比较无明显改变,4周时干骺端可见低密度影,似见囊变区,8周时关节间隙模糊不清,骨质结构不清; MRI检查4周部分动物可见局部信号改变,8周时可见皮质下出血;HE染色显示骨髓周围有坏死的骨髓细胞碎片存在,空骨陷窝率4周及8周逐渐增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);电镜观察,4周时个别骨细胞结构模糊不清,或有大空泡;8周时部分骨细胞核破裂、核溶解,凋亡细胞大量出现,骨胶原结构排列紊乱;②.从兔颈后脂肪组织中培养出ASCs细胞,其体外增殖迅速,倍增稳定,体外传18代增殖能力无明显降低(P0.05),免疫荧光检测ASCs的表面抗原CD44阳性,且细胞保持未分化状态,经成骨诱导培养后出现钙沉积;经成脂肪诱导后形成脂肪滴;采用1.0、1.5、2.0 mg/ml三种不同胶原酶浓度进行消化,发现在消化时间为0.5h和1h时,2.0 mg/ml组消化细胞总数最多,细胞总数与其他组比较,差异有显著意义。在消化时间为1.5h时,消化细胞总数较0.5h和1h均有增加,同时,1.0、1.5和2.0 mg/ml组消化细胞总数无统计学差异,活细胞比值1.0mg/ml组最高,但与其他组无统计学差异,观察第3代细胞生长特性,1.0mg/ml消化1.5h组别具有更好的增殖活性;③.经rhBMP-2成骨诱导1周、2周后,成骨标记物AKP、Ca+浓度与对照组比较差异有显著性(P0.O1),AKP浓度在P12代之前无统计学差异(P0.05),P15代与P9代之前均有统计学差异,Ca+浓度P12代之前无统计学差异(P0.05);P15代与P12代之前均有统计学差异(P0.05),Von Kossa染色出现钙结节,碱性磷酸酶染色显示胞浆出现红棕色颗粒存在。 结论: ①.联合运用激素和马血清明显提高ANFH的发生率,能够较好地建立激素性兔ANFH动物模型; ②.从兔脂肪组织中可获得ASCs细胞,具有多向分化能力,具有较强的自我增殖能力,有可能成为骨组织工程想的种子细胞之一; ③.胶原酶浓度1.0mg/ml、消化时间1.5h是较好的获取ASCs细胞的方法; ④.ASCs在12代以前其成骨能力无明显改变,有可能为骨组织工程提供大量的有活性的种子细胞。
【图文】：
对照组 2周 4周 8周图 1-1 兔血甘油三酯及胆固醇在 2 周、4 周、8 周时的变化表 1-1 各组 APTT 各时间点的结果( X +S)时间 Ａ组◇ Ｂ2 周 25.10±0.36 39.22±4 周 17.87±0.47☆ 39.16±8 周 17.10±0.51★ 38.68±与Ｂ组相比较，APTT 均有显著性差异，P<0.05；☆与第 2 周比意义，P<0.05；★与 2、4 周比较差异有统计学意义，P<0.05。图 1-图 A 面完见，
图ATR520，TE26短T1短T2，，正常股骨头T1WI表现
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329
【参考文献】
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