重组人proEMAPⅡ结构与功能的研究

发布时间：2020-01-18 18:45

【摘要】： 本研究旨在构建proEMAPⅡ/p43缺失突变体,探寻p43蛋白行使抗新生血管功能的结构域,筛选分子量小、活性高的肿瘤治疗候选药物;建立体外检测p43抗血管生成活性的方法;利用基因芯片高通量筛选p43作用于人微血管内皮细胞HMEC-1后差异表达的基因,初步研究p43蛋白的作用机制。本文利用内皮细胞增殖、细胞周期、细胞迁移、管腔形成和鸡胚绒毛尿囊膜实验等体外检测血管生成的模型研究p43蛋白抑制血管生成的活性。结果表明,p43体外能明显抑制HMEC-1细胞迁移和管腔形成,但对HMEC-1细胞增殖和细胞周期没有显著的量效关系。最终选用细胞迁移实验和管腔形成实验作为p43蛋白主要活性检测方法。同时制备了p43的多克隆抗体和单克隆抗体,为研究p43的生物学功能和作用机制奠定基础。通过对p43进行结构预测,构建了10个缺失突变体。在大肠杆菌内表达,得到可溶性的缺失体蛋白,利用金属鳌合层析和离子交换层析分离纯化,得到纯度达90%以上的目的蛋白。对纯化后的缺失体蛋白进行HMEC-1细胞迁移和管腔形成实验,体外测定其抗血管生成活性,成功地筛选出3种活性高于全长p43的缺失体蛋白。N端17-312位和80-312位氨基酸序列缺失突变体活性提高了3倍;C端1-264位氨基酸序列缺失体活性提高了2倍。结果表明,p43的1-79位和265-312位氨基酸片段不是p43蛋白发挥抗血管生成活性所必需的结构域。利用基因芯片筛选出p43作用于HMEC-1后差异表达的基因132个,从中选出与血管生成相关的31个基因,用Real-time PCR法对其进行验证,研究p43蛋白对其表达的调控,进而从分子水平上揭示p43的作用机制。
【图文】：

过程图,血管生成,过程,血管生成因子

并受多种血管生成因子的调控，持续异常的血管生成会导致一系列的疾病，如糖尿病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和恶性肿瘤。肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤血管生成有着密切的关系。1971 年 Folkman[1]首先提出用抑制血管生成的方法治疗肿瘤，现已有多种新生血管抑制剂类抗肿瘤药物上市或进入临床新生血管抑制剂已经成为肿瘤治疗研究的前沿和热点。一、血管生成与肿瘤1 血管生成的过程血管生成是一个复杂的连续的过程，人为地可分为 6 个相对独立的步骤：(1释放多种血管生成因子；(2)在血管生成因子的作用下，血管内皮细胞发生形态改变；(3) 释放多种蛋白溶酶降解细胞外基质和毛细血管基底膜，继而引起细胞外基质重塑；(4)内皮细胞迁移到刺激部位形成血管新芽；(5)血管内皮细胞增殖；(6)新生内皮细胞索形成管腔，血管结构重建[2,3]（图 1）。

内皮,单核细胞,前体,多肽

/p43 的研究背景43 的简介内皮单核细胞活化多肽（EMAPⅡ）的前体Q 等人发现。人的 p43 基因位于 4 号染色体外显子，，ATG 位于第 2 个外显子上。其转录产产物即 p43 蛋白由 312 个氨基酸残基组成，空间结构未知，但 COOH 端结构已知，主要OB-fold）和一个β-barrel 结构[32]（见图 2）。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R341

【参考文献】