BCG-CpG-DNA和Vaccae佐剂对乙肝疫苗免疫反应的影响及机制初探

发布时间：2020-01-19 14:13

【摘要】： 佐剂在疫苗的使用及发展中担负着重要作用。很多传统疫苗如果没有佐剂作用,其免疫效果受到极大影响,特别是对一些新型疫苗(如DNA疫苗)的研发或改进,有效佐剂是一个重要的突破点。迄今,人类研究的佐剂种类繁多,但人用佐剂仍以铝佐剂为主。虽然Novartis公司已经将MF59作为佐剂用于复立达(流感病毒亚单位佐剂疫苗)在欧洲各国获批准,但是美国食品药品管理局(FDA)至今未予批准,我国国家食品药品监督管理局也是07年才批准其在中国上市的。GSK公司的宫颈癌疫苗Cervarix采用的AS04佐剂也属于人用佐剂,已获欧盟专利,但在我国尚未批准上市。目前研究的众多佐剂中,尽管有些佐剂具有较强的免疫刺激活性,但因毒副作用大而限制其临床研究。本课题主要研究了两种生物佐剂:BCG-CpG-DNA(简称CpG)和Vaccae(微卡,即母牛分支杆菌菌苗,简称Va)。BCG-CpG-DNA是本实验室从BCG中提取的天然CpG DNA,它除了具有一般CpG的良好免疫刺激活性,还因为BCG作为疫苗在世界范围内沿用多年,证明其具有良好的安全性,而安全性正是限制目前大部分在研佐剂进入临床研究的瓶颈。Vaccae作为双向免疫调节剂,有较好的免疫刺激效果,目前已有较多将Vaccae联合乙肝疫苗治疗慢性乙型肝炎的实验研究。本研究通过体外细胞水平实验和小鼠体内刺激实验,初步探讨上述两种佐剂的免疫刺激活性,并将两种佐剂分别联合不含氢氧化铝佐剂的重组乙肝疫苗(HBsAg)和含氢氧化铝佐剂的重组乙肝疫苗(Al(OH)3-HBsAg),观察单独生物佐剂及联合佐剂(CpG / Va +Al(OH)3)对乙肝疫苗免疫后免疫反应的影响并初步探讨其作用机制。利用体外细胞水平刺激实验和小鼠体内刺激实验,探讨CpG和Va的免疫刺激活性。主要实验方法包括:1)佐剂对吞噬细胞吞噬功能的影响:采用碳粒廓清实验,比较经CpG / Va免疫的小鼠与未经佐剂免疫的对照组小鼠的吞噬细胞吞噬功能是否存在差异;2)佐剂体外刺激试验:用CpG / Va单独或联合ConA体外刺激BALB/c小鼠的脾淋巴细胞,ELISA法测定细胞培养上清中IFN-?和IL-10分泌水平,判断佐剂体外是否具有刺激Th1/Th2类细胞免疫的活性;3)佐剂小鼠体内刺激试验:经CpG / Va免疫C57BL/6小鼠,每7天免疫1次,共免疫3次,末次免疫后7天取脾淋巴细胞,用ELISPOT法测定IFN-?和IL-10的分泌水平,用MTT法测定体外培养68小时后的脾淋巴细胞的增殖能力,分析CpG / Va的细胞免疫刺激活性。我们将CpG / Va作为佐剂联合重组HBsAg和重组乙肝疫苗(含氢氧化铝佐剂的重组HBsAg)免疫小鼠,具体分组为:N.S.组、Ag组、Va+Ag组、CpG+Ag组、Al+Ag组、Va+Al+Ag组和CpG+Al+Ag组。通过以下实验观察佐剂对乙肝疫苗免疫反应的影响、并初步探讨佐剂的作用机制。主要实验方法包括:1)病理学研究:于免疫后不同时间采集经各组小鼠的注射部位肌肉、脾脏和淋巴结,制作组织切片,进行HE染色,观察佐剂对组织的病理学影响;2)佐剂的抗原递送及缓释作用研究:通过ELISA法测定组织匀浆和血清中HBsAg,比较不同免疫组小鼠组织内的HBsAg含量-时间变化趋势,分析佐剂是否存在抗原递送(antigen delivery)及抗原缓释作用;3)佐剂对疫苗细胞免疫应答影响:ELISPOT法测定含不同佐剂疫苗免疫小鼠后Th1型免疫应答的变化;4)佐剂对疫苗体液免疫应答影响:于免疫后不同时间,采用ELISA法测定小鼠体液免疫应答水平,判断不同佐剂对于抗原特异性抗体出现的时间以及量的影响。佐剂的免疫刺激活性研究结果显示:1)CpG和Va对小鼠吞噬细胞的吞噬功能影响不明显;2)CpG在体内、体外均能够诱导小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-?,并能够增强ConA刺激脾淋巴细胞分泌IFN-?的能力;CpG在体内、体外不能明显刺激脾淋巴细胞分泌IL-10。Va在体内、体外诱导IFN-?分泌的能力不明显,但能诱导分泌高水平的IL-10,并能增强ConA刺激脾淋巴细胞分泌IFN--?的能力,抑制ConA刺激脾淋巴细胞分泌IL-10的能力。3)CpG和Va均能刺激小鼠淋巴细胞的增殖。由上述结果可以初步判断CpG具有诱导Th1型细胞免疫刺激的活性,而Va则能够诱导Th1型和Th2型细胞免疫应答。佐剂联合重组乙肝疫苗研究结果显示:1)CpG和Va有增加注射部位肌肉炎细胞浸润的趋势;2)CpG和Va本身具有轻微的抗原缓释作用,在免疫后1天时,注射部位肌肉中抗原含量比不含佐剂的HBsAg组高2~4倍,但比Al(OH)3的缓释作用弱;而CpG / Va与Al(OH)3存在协同缓释作用,联合佐剂组在免疫后4~10天左右注射部位肌肉中抗原含量较单独Al(OH)3佐剂组高;3)CpG和Va佐剂的应用利于大量HBsAg进入脾脏,CpG / Va联合Al(OH)3较单独CpG / Va佐剂抗原递送作用增强;4)含CpG佐剂的重组乙肝疫苗在免疫后7天能有效诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌Th1细胞因子(IFN-?和IL-2);含Va佐剂的重组乙肝疫苗在免疫后7天诱导小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-?、IL-2水平较低,Va+Al佐剂对IFN-?、IL-2的诱导能力大于单独Va佐剂组(也大于单独Al佐剂组),加强免疫1针后的阳转比例有所升高;并且Th1型细胞免疫应答水平与HBsAg剂量有关,抗原免疫剂量为3μg的组别在免疫后7天阳转比例大于抗原免疫剂量为1μg的组别;5)CpG和Va均能提高HBsAg免疫后血清抗体滴度。CpG和Va与Al(OH)3之间均存在协同作用,与单独使用HBsAg相比,能够提早血清抗体的产生,并使抗体滴度提高。综上所述,这两种佐剂均具有一定程度的细胞免疫刺激活性。作为佐剂对于乙肝疫苗免疫后的抗原递送和缓释具有一定作用,并且能够提高小鼠对重组乙肝疫苗的细胞免疫应答和体液免疫应答水平,有望作为疫苗佐剂。
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培养基,对照组,实验结果,情况

图 3. Va/CpG 体外刺激小鼠脾淋巴细胞后 MTT 实验结果2.712 2.6586.41513.79913.1664.8075.596.20102468101214161820CpGVaConACpG+ConAVa+ConALPSCpG+LPSVa+LPS刺激原IS图 4. Va/CpG 体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖情况3.1 Va 和 CpG 体外能刺激脾淋巴细胞增殖CpG、Va、ConA 和 LPS 与不加刺激原的对照组（用完全培养基 1

Va/CpG体内刺激C57BL/6小鼠MNCs分泌IFN-γ酶联免疫斑点形成细胞数(n=8)
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】